HPLC 數據處理入門
從一張層析圖到一個濃度數字

1先看懂一張層析圖

HPLC（高效液相層析）做的事情很單純：把混合樣品打進一根管柱， 不同的成分會用不同的速度通過管柱，於是先後流出來。 出口有一個偵測器，把「每個時刻流出來多少東西」記錄成一條曲線——這就是層析圖。

這批資料裡有兩個目標物，它們是食品最常見的兩種防腐劑：

2核心觀念：檢量線

偵測器只會給你「面積」這個數字，它不知道濃度。 那怎麼把面積換成濃度？答案是先拿已知濃度的樣品去問。

原圖（五個濃度）放大低濃度

我們配了 5 瓶標準品——濃度分別是 0.25、10、25、50、100 ppm，每瓶都跑一次 HPLC。 把「濃度」和「量到的面積」畫成一張圖，會得到一條直線。 這條線就是檢量線，之後任何未知樣品只要量出面積，就能反過來讀出濃度。

3動手做（一）：算出檢量線

好消息是：儀器軟體 LCsolution 匯出的檔案裡，已經幫你算好每個峰的面積了。 所以第一版分析只要把這些面積讀出來、配一條線就好。

1. 確認 D:\claude\BASA_hplc 裡有 11 個資料檔（5 個標準品 + 6 個樣品）。
2. 打開命令列，切換到那個資料夾。
3. 執行一行指令。

python hplc_calib.py

幾秒後 results/ 資料夾就會出現檢量線圖、報表 CSV，畫面上也會印出結果。 你得到的檢量線是：

公式裡的 Area 是峰面積、C 是濃度。 要反推濃度就是把公式倒過來：濃度 =（面積 − 截距）÷ 斜率。

4遇到問題：峰會跑掉

如果事情這麼簡單就好了。實際看資料時會發現一個麻煩： 同一個物質，在不同時間跑出來的圖上，出現的時間不完全一樣。

這批資料裡，sample-1 到 sample-3 是上午跑的，標準品是下午跑的， 中間管柱溫度、流動相都有些微變化，結果上午那幾張圖整體往左偏了約 0.09 分鐘。

0.09 分鐘聽起來很小，但儀器是用「時間視窗」來認峰的—— 它會說「5.90 到 6.00 分之間出現的峰就是己二烯酸」。峰偏出這個範圍，儀器就認不出來：

解法就是峰對位（peak alignment）：先把每張圖的峰推回共同的時間軸上，再來積分。 就像把幾張沒對齊的照片疊起來之前，先把它們對準一樣。

5動手做（二）：用 alignDE 對位

alignDE 是一個 R 套件，專門做這件事。它的做法可以這樣理解：

1. 找出峰在哪裡——用一種叫「小波」的數學工具掃過整條曲線。 它的好處是不會被雜訊騙：雜訊產生的假峰在放大檢視時會消失，真的峰不會。
2. 量出每個峰的頭尾——這同時也決定了等一下要從哪裡積分到哪裡。
3. 扣掉基線——把偵測器的漂移減掉，讓面積只算真正的訊號。
4. 試出該平移多少——電腦自動嘗試各種平移量，找出「和標準品最像」的那一個。 關鍵是它只平移峰、不拉扯峰本身，所以峰面積不會被改變。

安裝一次，之後就只要跑一行：

# 只需要做一次的安裝
Rscript -e "install.packages(c('DEoptim', 'Matrix', 'remotes'))"
Rscript -e "remotes::install_github('Tai-ShengYeh/alignDE')"

# 每次分析都跑這行
Rscript hplc_alignDE.R

跑完會在 results_align/ 得到對位後的完整結果。實際套用的平移量是：

（沒有列出的檔案表示不需要平移。）

6怎麼判斷做得對不對

跑出數字很容易，難的是知道這些數字能不能信。看三個地方就好。

檢查點 1：回收率（最重要）

把標準品自己的面積代回檢量線，看能不能還原成原本的濃度。 0.25 ppm 的標準品應該要算回 0.25 ppm 附近。一般可接受範圍是 85–115%。

檢查點 2：報告下限

低於最低標準品濃度（本例 0.25 ppm）的結果，不應該直接報數字，要寫 N.D.（未檢出）。 因為那個範圍根本沒有用標準品校正過，數字是外推出來的，不可信。

檢查點 3：兩套方法對不對得起來

本專案刻意做了兩套獨立流程：一套直接用儀器算好的面積，一套自己從原始訊號重新積分。 兩套算出來的濃度如果接近，就有信心；差很多的地方就要人工看一下。

N.D. = 未檢出（低於報告下限 0.25 ppm）。

7新手最常踩的坑

坑一：標準品濃度跨太多倍時，直接配線會出大錯

本例的標準品從 0.25 到 100 ppm，跨了 400 倍。 如果用最普通的「最小平方法」配一條線，這條線會被 100 ppm 那個點整個拉過去， 低濃度端完全失準：

解法叫做加權：讓低濃度的點在配線時擁有比較大的發言權。 標準做法是給每個點 1/C² 的權重（C 是該點濃度）。本專案的程式已經預設這樣做了， 你只要知道：濃度範圍超過大約 50 倍時，一定要加權。

坑二：把 N.D. 當成 0

「未檢出」的意思是低於偵測能力，不是確定沒有。報告時應該寫 「N.D.（< 0.25 ppm）」，而不是 0。

坑三：微量的峰不要盡信

峰越小，基線畫在哪裡對面積的影響就越大。本專案比較過兩種基線演算法， 主要的峰結果差異都在 2% 以內，但接近報告下限的微量峰可以差到 50%。 接近下限的數字，一定要人工看過原始圖。

8名詞對照表

HPLC

高效液相層析。把混合樣品分離成單一成分再逐一偵測的儀器。

層析圖 / chromatogram

偵測器訊號隨時間變化的曲線，也就是本文一直在看的那張圖。

峰 / peak

曲線上凸起的部分，代表有某個成分在那個時間流出來。

滯留時間 / retention time (RT)

峰出現的時間點，用來判斷「這是什麼物質」。

峰面積 / peak area

峰下方的面積，和該物質的量成正比，是定量的依據。

基線 / baseline

沒有成分流出時的訊號水平。峰面積要從基線往上算。

標準品 / standard

已知濃度、用來建立檢量線的溶液。

檢量線 / calibration curve

「峰面積 vs 濃度」的關係線，用來把面積換算成濃度。

回收率 / recovery

把標準品代回檢量線後，算出來的濃度佔標示濃度的百分比。理想是 100%。

LOD / LOQ

偵測極限 / 定量極限。低於 LOQ 的結果不應該報數字。

N.D.

Not Detected，未檢出。表示低於報告下限，不等於 0。

峰對位 / peak alignment

把不同批次層析圖的峰推回共同時間軸的處理。

ppm

百萬分之一。液體樣品中 1 ppm = 1 mg/L。

9隨堂測驗

四題，點選答案會立刻告訴你對不對。

10下一步

這裡是第 1 站。接下來還有兩站，照順序讀最順：

本專案的檔案