NIELSEN'S FOOD ANALYSIS · CHAPTER 12

層析原理

Basic Principles of Chromatography

食品分析　·　3 小時課程　·　含 6 個互動小遊戲
萃取 · 移動相/固定相 · 分配係數 · 七大分離模式 · 解析度

ExtractionPartition KGC/LC/SFC7 modesResolution

先想一想

一杯混合液裡的成分，怎麼一個一個分開？

食品裡常是數十種成分的混合物。要定性、定量，
第一步往往是——把它們分離 (separation) 出來。

色素分離胺基酸脂溶性維生素多酚糖類

12.1 為什麼重要

層析：分析科學的基石

🌈

分離混合物

把複雜樣品中的各成分逐一分開，是定性/定量的前提

🔬

應用極廣

胺基酸、蛋白、脂質、醣類、酚類、摻假物皆可分析

⚙️

技術多元

材料、設備、方法種類繁多，可彈性搭配

🚀

品質控制

食品成分與產品的特性分析與品管

12.2 先談萃取

萃取：分離的起點

批次萃取：與第二種不互溶溶劑搖盪，溶質依分配分布
連續萃取：如 Soxhlet，溶劑循環反覆萃取
逆流萃取：多管串聯，分離分配係數相近的溶質
每一管的平衡 ≈ 層析的一個理論板

分配係數 K：溶質在兩相濃度之比 (式 12.1)。
K = 相 1 濃度 ÷ 相 2 濃度。逆流萃取正是層析的概念前身。

12.4.1 極性序

極性決定洗脫順序

資料：Table 12.4 化合物類別極性序（依極性遞增排列）。課本只給順序、沒有數值——柱高僅代表序位 1–11，不是極性大小的量測值。

核心命題

兩相之間，不斷分配

層析的本質：溶質在移動相與固定相之間反覆達成平衡。

分配係數 K = 移動相中溶質濃度固定相中溶質濃度
與固定相作用越強 → 走得越慢 → 越晚洗出

12.3.1 歷史

從色素到層析學

🌿

1903 Tsvet

俄國植物學家用碳酸鈣管柱分離葉片色素，命名 chromatography

🧪

1941 Martin & Synge

發展液–液分配層析，奠定理論板概念

⛽

1960 年代末 GC

因石油工業需求，成為第一個商品化的精密層析儀器

🚀

HPLC / SFC

HPLC 借 GC 理論與儀器進展發展；SFC 1962 首次展示，近年漸用於食品分析

小遊戲 ①三種層析依「移動相」分類0 / 6

移動相是什麼狀態？把 6 個關鍵字分到三類。

12.3.2 一般術語

層析家族樹

依移動相分為 GC / LC / SFC；液相層析再分為平面式（紙、薄層 TLC）與管柱式。

12.3 管柱層析

管柱裡發生了什麼

移動相帶著樣品流過固定相
各成分與固定相作用強弱不同
作用弱者走得快 → 先洗出；作用強者後出
出柱後經偵測器產生峰 (peak)

1903 年 Tsvet 用碳酸鈣管柱分離葉片色素，命名「chromatography」。

12.4 七大分離模式

依物理化學原理區分

🧲

吸附 / 分配

正相·逆相：靠極性差異 (van der Waals / 溶解度)

💧

HILIC / HIC

親水交互作用 / 疏水交互作用

⚡

離子交換

靜電作用，依電荷分離

🔑

親和 / 排阻

專一結合 (affinity) / 依分子大小 (SEC)

同一分離常牽涉不只一種機制；整理自 Table 12.3。

小遊戲 ②層析原理即時測驗0 / 4

12.4.1 / 12.4.2

正相 vs 逆相

🟠

正相 Normal-phase

固定相極性(silica)、移動相非極性；非極性先出、極性後出

🔵

逆相 Reversed-phase

固定相非極性(C8/C18)、移動相極性(水/乙腈)；極性先出

逆相 HPLC 是食品分析最常用：維生素、多酚、類胡蘿蔔素、類黃酮。

12.3.5 超臨界流體

SFC：介於 GC 與 LC

🌫️

移動相

超臨界 CO₂（介於氣/液之間），可調壓力、溫度與組成

🧴

強項

分析非揮發·熱不安定物；脂質、脂溶性維生素、Sudan 染料

分析時間短、溶劑用量少；可用填充或毛細管柱，並可接質譜 (MS)。

12.4.5 離子交換

靠電荷分離

➖

陽離子交換

固定相帶負電(RSO₃⁻/RCO₂⁻)，抓陽離子

➕

陰離子交換

固定相帶正電(R-NHR'₂⁺)，抓陰離子

溶離策略：改變pH 或提高離子強度(如加 NaCl) 以削弱靜電作用。

12.4.6 親和層析

Affinity：專一鎖定

固定相接上專一配基(抗體、酵素抑制劑、凝集素)
只有目標分子被專一結合，其餘直接洗掉
改 pH / 離子強度，或加競爭配基即可溶離
純化單一蛋白的高選擇性利器

「鑰匙–鎖」式的辨識：靠生物專一性而非極性或電荷，純化倍率極高，常一步到位。

小遊戲 ③層析分析流程排序— / 7

用 ▲▼ 把一次完整層析分析的 7 個步驟排成正確順序。

12.4.7 排阻層析

SEC：依大小篩分

固定相為多孔膠體(如 Sephadex 葡聚醣)
大分子進不了孔洞 → 走孔隙體積 → 先洗出
小分子鑽進孔洞 → 路徑長 → 後出
可估蛋白質分子量(Kav vs log MW 檢量線)

與其他模式相反：大分子先出、小分子後出。溫和條件少變性，常作為純化的早期步驟，也可替代透析脫鹽。

12.5.1.2.2 Van Deemter

找出最佳流速

Van Deemter 式 12.8：HETP = A + B/u + Cu（x 軸為真實數值間距）。示意：常數 A、B、C 為假設值，非課本數據（課本 Fig 12.13 為無數值的示意圖）。HETP 越小、效率越高；流速太低 B/u 主導、太高 Cu 主導。

12.5.1.2.1 滯留時間

讀懂層析圖

⏱️

滯留時間 t_R

成分從進樣到出峰所需時間（或滯留體積 V_R）

💨

空容時間 t₀

不被滯留的成分(溶劑前緣)通過管柱的時間

✂️

校正滯留 t'_R

t'_R = t_R − t₀，扣掉系統死體積後的真實滯留

📐

峰寬 w

基線寬度 w = 4σ；峰不對稱或未完全分開時，半高寬 w½ 較準

跨系統比較時用校正滯留時間 t'_R 較可靠。

12.5.1 解析度

把峰分得開

解析度 Rs 越大，兩峰分得越開。Rs = 2Δt / (w₁+w₂)（式 12.4），通常 Rs ≥ 1.5 視為基線分離。

12.5.1.2 三要素

效率 · 選擇性 · 容量

📊

效率 N

理論板數 N=16(t_R/w)²；板越多、峰越窄。HETP=L/N

🎯

選擇性 α

分離因子 α=t'_R2/t'_R1；峰間相對距離

⏱️

容量因子 k'

k'=(t_R−t₀)/t₀；停留在固定相的程度，常取 1–15

Rs 與選擇性線性相關，但與效率僅平方根相關——N 要 4 倍才讓 Rs 加倍。

小遊戲 ④固定相依「化學本質」分類0 / 6

換個角度——這些分離模式的固定相本質是什麼？分到三類。

12.5.3 定量分析

內標 vs 外標

🧮

外標法

另外配標準品分開進樣，建峰面積–濃度檢量線；需偵測器穩定

🎯

內標法

加入已知量內標物，用峰面積比校正；補償前處理損失與進樣誤差

內標物須與分析物性質相似但分得開、且樣品中本不存在（Table 12.7）。

小遊戲 ⑤決策挑戰：選對模式0 / 5

12.4 模式比較

一張表選分離模式（點欄位排序）

模式 ⇅	固定相 ⇅	移動相 ⇅	依何分離 ⇅

整合自 Table 12.3。點欄位標題可排序。

方法選擇

跟著決策樹走

簡化自 Fig 12.10（小分子離子也可用離子對逆相或逆相）。下一頁實戰：算兩個峰的解析度 Rs →

12.5.1 計算

解析度：從滯留時間到 Rs

R_s = 2 · Δtw₁ + w₂

Δt = 兩峰滯留時間差 (t_R2 − t_R1)
w₁、w₂ = 兩峰基線寬度
Rs 越大、分得越開
Rs ≥ 1.5 ≈ 基線分離

小遊戲 ⑥計算闖關未作答

兩個層析峰：t_R1 = 10.0 min、t_R2 = 12.0 min，基線寬 w₁ = w₂ = 1.0 min。求解析度 Rs（無單位）。

重點整理

今天的五個關鍵

層析＝溶質在移動相與固定相間反覆分配
依移動相分 GC / LC / SFC；液相再分平面與管柱
七大模式：吸附·分配·HILIC·HIC·離子交換·親和·排阻

峰的好壞看 Rs、N、α、k'；Van Deemter 找最佳流速
定量靠峰面積＋標準品：內標補損失、外標建檢量線

自我檢核

今天結束，你應該會…

✓用「兩相分配」解釋層析的基本原理
✓畫出層析家族樹並說明 GC/LC/SFC 的差別
✓說出七大分離模式各自靠什麼分離
✓比較正相與逆相、陽離子與陰離子交換
✓判斷該用哪種模式（小分子/離子/大分子）
✓由滯留時間與峰寬算出解析度 Rs
✓區分內標法與外標法的用途

點一下打勾——確認自己真的會了。

下一步 · NEXT

把層析原理
用起來

📌 課後練習：Study Questions、Practice Problems
🔜 銜接章節：HPLC (Ch13)、氣相層析 GC (Ch14)
🧪 思考：你的樣品是小分子還是大分子？帶電荷嗎？該選哪種分離模式？

GCLC/HPLCSFCIECSEC