HPLC · CH13
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NIELSEN'S FOOD ANALYSIS · CHAPTER 13

高效液相層析

High-Performance Liquid Chromatography
食品分析　·　3 小時課程　·　含 6 個互動小遊戲
幫浦 · 注射器 · 管柱 · 偵測器 · 分離模式 · 檢量線定量
HPLC逆相 RPUV-Vis梯度沖提檢量線UHPLC
先想一想
一杯咖啡裡有幾百種成分，怎麼把它們分開、量出來？

把樣品溶進液體「移動相」，用高壓推過裝滿固定相的管柱。
各成分與固定相的作用力不同，前後分批流出——這就是液相層析。

糖類維生素 胺基酸色素農藥殘留黴菌毒素
13.1 為什麼用 HPLC

比傳統管柱層析強在哪

📦
固定相多元
預裝管柱、各種固定相可選，分離模式比傳統更多
🔬
解析度高
小顆粒填料 + 高壓 → 波峰更窄、分得更開
⚡
速度快
多數分析 30 分鐘內完成，高通量
📈
靈敏多樣
多種偵測器可選、易回收、可接質譜 MS
13.1 HPLC 是什麼

高壓推一管分配差異

  • 1960 年代發展，原指高壓液相層析
  • 1970 末改稱高效能，強調解析度與通量
  • 凡能溶於移動相的化合物都可分析
  • 分析為主，亦可半製備(收集純化分離出的成分)
核心：分離 = 各成分在固定相/移動相間「分配」程度不同。
作用力強者被拉住、晚出；作用力弱者先流出 → 在時間軸上分開。
13.3 食品應用

HPLC 在食品的應用有多廣

資料整理自 Table 13.1：各類食品成分常以 HPLC 分析（示意筆數）。
核心命題
先分離，再偵測，最後定量

一套 HPLC 的工作邏輯：幫浦推移動相 → 注入樣品 → 管柱把成分分開 → 偵測器轉成訊號 → 用檢量線由波峰面積算濃度。

波峰面積 ∝ 濃度
用標準品建檢量線：面積 → 濃度
小遊戲 ①偵測器「測什麼」分類0 / 7
每種偵測器靠什麼性質出訊號？把 7 個偵測器分到三類。
13.2 系統元件

HPLC 的五大元件

🫧
幫浦 Pump
精準推送移動相，0.2–2 mL/min
💉
注射器 Injector
把樣品送入流動的移動相
🧱
管柱 Column
裝固定相，分離的主舞台
📡
偵測器 Detector
濃度變化 → 電訊號
第五個是資料站：顯示層析圖、積分波峰、自動跑樣與報告。
13.2 儀器流程

訊號怎麼一路傳下去

溶劑槽 移動相 (eluent) 幫浦 0.2–2 mL/min 注射器 定量環 10–100µL 管柱 固定相·分離 偵測器 訊號→波峰 資料站 層析圖·積分 HPLC 系統流程 (Fig. 13.1) 高壓推送移動相，樣品隨之過管柱被分離
記住順序：溶劑槽 → 幫浦 → 注射器 → 管柱 → 偵測器 → 資料站。管柱與偵測器常可恆溫。
13.2.1 幫浦

Pump：穩定才準

  • 流速 0.2–2 mL/min，準確度 ±1%、精密度 <0.1% RSD
  • 九成以上為往復式活塞幫浦(雙活塞最佳)
  • 會產生脈動 → 需脈衝阻尼器(RI 偵測對脈動敏感)
  • 材質 316 不鏽鋼；移動相需過濾(0.22/0.45µm)、脫氣
流速穩定 → 滯留時間與波峰面積才能重現。
梯度沖提靠低死體積幫浦快速換溶劑。
13.2.2 注射器

Injector：載入 vs 注入

(a) LOAD 載入 定量環 sample loop 幫浦 管柱 注射針 廢液 幫浦→管柱直通；注射針把樣品灌進定量環 (b) INJECT 注入 定量環 sample loop 幫浦 管柱 注射針 廢液 閥旋轉：幫浦→定量環→管柱，把樣品帶上管柱
閥式注射器用定量環：LOAD 灌樣、INJECT 旋轉讓環接入流路。典型注入 10–100 µL；接自動進樣器可大量、可冷藏、提升精密度。
13.2.3 管柱

Column：分離的舞台

🧱
硬體
不鏽鋼/玻璃/PEEK；分析柱常 10–25 cm × 4.6 mm
🛡️
保護柱
裝在分析柱前，擋強吸附物；每 50–200 針更換
⚪
填料
多孔矽膠或聚合物樹脂；小顆粒→高效率但高背壓
🚀
UHPLC
≤2µm 顆粒 + 超高壓(15000–20000 psi)，更快更省溶劑
小遊戲 ②元件即時測驗0 / 4
13.2.4 偵測器家族

四種常見偵測器

🔆
UV-Vis 吸收
測發色團；固定/可變波長/二極體陣列(200–700nm)。最常用
✨
螢光 Fluorescence
選擇性高、靈敏度可達 UV 的 1000 倍；適微量
💧
折射率 RI
近乎通用，但靈敏度低、不能用梯度；測醣/脂
⚡
電化學 EC
氧化還原/導電度；高選擇高靈敏；測兒茶酚胺、醣
13.2.4 靈敏度比較

偵測器靈敏度差很多

示意相對偵測極限（數字越大越靈敏，對數示意）。整合自 13.2.4。
沖提方式

等度 vs 梯度沖提

➖
等度 Isocratic
移動相組成全程不變；簡單、基線穩；適成分性質相近
📈
梯度 Gradient
運行中逐步改變移動相組成；分得開、波峰更銳
梯度幾乎用於所有模式，唯獨尺寸排阻(SEC)不用；RI 偵測也不能搭梯度(組成一變、基線就漂)。
小遊戲 ③元件「功能」配對0 / 6
把每個元件配到它負責的工作。分到三大功能。
13.3 分離模式

四種主要分離模式

🟠
逆相 RP
非極性固定相(C18) + 極性移動相；最常用(>70%)
🔵
正相 NP
極性固定相 + 非極性移動相(己烷)；分極性化合物
🟢
離子交換 IEC
帶電樹脂分離離子；緩衝液、導電度偵測
🟣
尺寸排阻 SEC
純依分子大小，大分子先出；測分子量
最常用的兩兄弟

逆相 RP vs 正相 NP

🟠
逆相 Reversed-Phase
固定相非極性(C18)、移動相極性(水/甲醇/乙腈)。依疏水性遞增流出。水多→滯留久(k′大)
🔵
正相 Normal-Phase
固定相極性(矽膠/氰基/胺基)、移動相非極性(己烷)。分脂溶性維生素、類胡蘿蔔素
口訣：「逆相＝固定相不愛水」——非極性柱配水性溶劑，剛好和正相相反。
其餘模式

離子交換 · 尺寸排阻 · 親和

🟢
離子交換 IEC
帶電官能基樹脂；改變離子強度/pH 控滯留；測無機離子、有機酸、糖
🟣
尺寸排阻 SEC
依分子大小篩分，大分子先出；測蛋白/多醣分子量；不用梯度
🎯
親和 Affinity
固定化配體與目標可逆專一結合；純化醣蛋白、葉酸
13.2.5 層析圖

讀懂一張層析圖

訊號 vs 時間：先出的滯留時間短，波峰面積反映含量(示意)。
關鍵參數

滯留係數 k′ 看什麼

k′ = tR − t0t0
  • tR＝滯留時間、t0＝死時間(不滯留物)
  • k′ 越大 → 被固定相拉得越久
  • RP：移動相水越多 k′ 越大；有機溶劑越多 k′ 越小
  • 弱溶劑→大 k′；強溶劑→小 k′
調 k′ 是調分離的第一招——想多留住分析物，就降低溶劑強度。
小遊戲 ④HPLC 分析流程排序— / 7
用 ▲▼ 把一次 HPLC 定量分析的 7 個步驟排成正確順序。
小遊戲 ⑤決策挑戰：選模式/偵測器0 / 5
13.2.4 偵測器比較

一張表選偵測器（點欄位排序）

偵測器 ⇅偵測依據 ⇅靈敏度 ⇅可梯度? ⇅典型應用 ⇅
靈敏度：★ 越多越靈敏。整合自 13.2.4。
方法選擇

跟著決策樹走

你的分析物是什麼？ 選擇 HPLC 分離模式 非極性小分子? 逆相 RP C18 柱·水/甲醇 最常用(>70%) 帶電的離子? 離子交換 IEC 緩衝液·導電度偵測 無機離子·有機酸 大分子分子量? 尺寸排阻 SEC 大分子先出·不可梯度 蛋白·多醣 專一純化? 親和 Affinity 固定化配體·可逆結合 醣蛋白·葉酸 偵測器同理：有發色團→UV-Vis；微量螢光物→螢光；無 UV 吸收(醣/脂)→RI 或 ELSD

下一頁實戰：用檢量線由波峰面積算濃度 →

定性與定量

標準品＋檢量線

🏷️
定性
用滯留時間對照標準品；二極體陣列可比對光譜
📐
定量
波峰面積對標準品濃度建檢量線(A=mC+b)
資料站自動積分波峰面積、套檢量線、扣內標、出報告。面積與濃度成正比，這是 HPLC 定量的根基。
13.3 計算

用檢量線：面積 → 濃度

C = A − bm
  • 檢量線 A = m·C + b(面積對濃度)
  • m＝斜率、b＝截距，由標準品迴歸得到
  • 測得樣品波峰面積 A → 反算濃度 C
  • 必要時再乘稀釋倍數回推原樣品
下一題：已知檢量線與樣品面積，求咖啡因濃度。
小遊戲 ⑥計算闖關未作答
咖啡因 UV 檢量線 A = 24.0·C + 5.0(C 單位 µg/mL，A 為波峰面積)。某飲料測得波峰面積 A = 605。求咖啡因濃度 C。
µg/mL
重點整理

今天的五個關鍵

  • HPLC＝高壓推移動相過管柱，靠分配差異分離成分
  • 五大元件：幫浦→注射器→管柱→偵測器→資料站
  • 模式：逆相(最常用)、正相、離子交換、尺寸排阻、親和
  • 偵測器：UV-Vis(最常用)、螢光(最靈敏)、RI(通用但不可梯度)
  • 定量靠檢量線：波峰面積 → 濃度(梯度除 SEC/RI 外皆可用)
自我檢核

今天結束，你應該會…

點一下打勾——確認自己真的會了。

下一步 · NEXT

把 HPLC
用起來

📌 課後練習：Study Questions（保護柱、偵測器原理、k′、IEC/SEC 範例）
🔜 銜接章節：氣相層析 (Ch12/14)、質譜 (Ch11)、胺基酸/蛋白分離 (Ch24)
🧪 思考：你的分析物極性如何？帶電嗎？有 UV 吸收嗎？該選哪種模式與偵測器？
逆相 RPUV-Vis螢光梯度檢量線UHPLC-MS