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Ch7 · UV-Vis 與螢光光譜法
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前測目的：讓學生暴露直覺迷思，而非評分。用錯誤最多的題開始討論。
%T = 50%，A = ？
→ 常見錯誤：A = 0.5（直接抄 T 值）
Beer's Law 中，T 正比於 c？
→ 錯！A 才正比於 c
離心機是分光光度計元件？
→ 混淆前處理與量測儀器
螢光法靈敏→因光源更強？
A = 1.8 要怎麼處理？
匯入檔：game_imports/kahoot_ch7.xlsx（前 5 題）
Nielsen Food Analysis · Chapter 7
Ultraviolet, Visible, and Fluorescence Spectroscopy
大學食品營養系二年級 ｜ 2–3 小時課程
P = 透射光強度 P₀ = 入射光強度
無單位，範圍 0–1（或用 %T = T×100）
= log(P₀/P) = 2 − log%T
吸光度（Absorbance），無單位
| %T | T | A | 判斷 |
|---|---|---|---|
| 100% | 1.0 | 0 | 完全透射 |
| 65% | 0.65 | 0.187 | ✓ 最佳下限 |
| 50% | 0.50 | 0.301 | 常考數值 |
| 15% | 0.15 | 0.824 | ✓ 最佳上限 |
| 10% | 0.10 | 1.0 | ✗ 太高 |
「透光率 T 越低 = 吸收越多 = 濃度越高」
T 與 c 的關係是指數：
T = 10−εbc
如果用 T 做校正曲線 → 曲線彎曲 → 高濃度誤差爆增
A = εbc → A 與 c 嚴格線性正比
取對數之後消去了指數關係：
A = −logT = log(P₀/P)
校正曲線用 A 對 c → 直線 → 可做線性回歸
🎯 即時小測：%T = 25%，A = ？
無單位，最佳 0.2–0.8
L·mol⁻¹·cm⁻¹
物質特性，λ 決定
cm，通常 1 cm
校正時須一致
mol/L
← 我們要測的！
| 物質 | λmax (nm) | ε (L·mol⁻¹·cm⁻¹) | 食品應用 | 靈敏度 |
|---|---|---|---|---|
| β-胡蘿蔔素 | 465 | 125,000 | 色素定量，高靈敏 | ★★★★★ |
| 1,3-丁二烯共軛體 | 217 | 21,000 | 脂質氧化指標 | ★★★★ |
| 色胺酸 Trp | 278 | 5,579 | 蛋白質定量（278 nm） | ★★★ |
| 苯酚 Phenol | 270 | 1,450 | 酚類含量測定 | ★★ |
| 醋酸 R-COOH | 208 | 32 | 有機酸（靈敏度極低！） | ★ |
光幾乎全透過
P ≈ P₀，差值太小
→ 相對誤差大
處理：濃縮樣品
或換更長光徑
（15–65%T）
相對誤差最小
Beer's Law 最準確
最佳點：A = 0.43
（%T = 37%）
光幾乎被吸盡
P 極小，噪音比例高
→ 相對誤差爆增
處理：稀釋樣品
後重測
🎯 你量到 A = 1.95，下一步？
匯入：game_imports/wordwall_ch7_match_A.csv
高濃度時分子間距縮短
分子互相影響彼此的電荷分布
ε 隨濃度改變 → 線性關係崩潰
弱酸/弱鹼 pH 改變時，解離/未解離型態比例改變
兩種型態的 ε 不同
稀釋改變平衡 → 有效 ε 改變
配製標準系列（涵蓋未知樣品濃度）
測空白（blank）設 A = 0 基準
建 A vs c 圖，線性回歸，r² > 0.999
由方程求未知樣品濃度
操作三決策
A = εbc，b 從 1→2 cm，A = 2A₀（正確答案：加倍）
高濃度分子間距縮短 → ε 改變（非光源問題）
寬 bandwidth → 高 A 端正偏離（非無影響）
石英/熔融矽（玻璃吸 UV 光）
補償光源漂移（非光更強）
多 dynode 串聯放大，靈敏度極高（非全波長）
匯入檔：game_imports/kahoot_ch7.xlsx（題 6–11）
第二段
五大元件 × 兩種設計
鎢絲燈
（Vis）
或氘燈
（UV）
反射光柵
分出單一 λ
狹縫控制
bandwidth
石英或
玻璃比色槽
通常 1 cm
光徑
光電管
PMT
或 DAD
（陣列）
電腦/顯示
輸出 A 值
或光譜圖
✅ 結構簡單、S/N 較佳
❌ 空白與樣品需分開測，光源漂移影響大
✅ 同時測空白與樣品，補償光源漂移，可掃光譜
❌ 光強減半，S/N 降低；結構複雜
| 光源 | 範圍 | 用途 |
|---|---|---|
| 鎢絲燈 | 350–2500 nm | 可見光+近紅外 |
| 氘放電燈 | 160–375 nm | UV 範圍 |
多數儀器雙燈配備，約 340–380 nm 自動切換
| 偵測器 | 特點 | 靈敏度 |
|---|---|---|
| 光電管 | 無放大，簡單 | 低 |
| PMT | 多 dynode 放大 10⁶–10⁹× | 極高 |
| DAD（陣列） | 同時偵測所有 λ | 中 |
PMT 最適合螢光/弱光；DAD 適合快速掃描光譜
🎯 測量茶葉中咖啡因（UV 275 nm），用一般玻璃比色槽可以嗎？
R-CHO、R-CO、R-COOH
ε 極小（<100 L·mol⁻¹·cm⁻¹）
需高濃度或衍生化才能定量
共軛雙鍵增加 → 電子離域化程度增加
HOMO-LUMO 能隙縮小 → 需更低能量光子（更長 λ）
ε 同步增大 → 靈敏度提升
| 物質 | 共軛雙鍵數 | λmax (nm) | ε | 食品意義 |
|---|---|---|---|---|
| 1,3-丁二烯 | 2 | 217 | 21,000 | 脂質氧化指標 |
| 番茄紅素 | 11（開鏈） | 470 | ~185,000 | 紅色色素 |
| β-胡蘿蔔素 | 11（環化） | 465 | 125,000 | 橘黃色素，高靈敏 |
匯入：game_imports/wordwall_ch7_match_B.csv
第三段
為什麼靈敏度比 UV-Vis 高 1000 倍？
| 比較項目 | UV-Vis 吸收法 | 螢光光譜法 |
|---|---|---|
| 訊號來源 | P₀ − P（被吸收的光） | Pf（激發後發射的光） |
| 量測角度 | 與入射光同軸（180°） | 垂直入射光（90°） |
| 核心公式 | A = εbc | Pf = k · P₀ · c |
| 靈敏度 | ★★★（ppm 級） | ★★★★★（ppb 級） |
| 靈敏度原因 | 差值訊號，背景干擾大 | 零背景量測，S/N 極高 |
| 食品應用 | 蛋白質、色素、還原糖 | 黃麴毒素、葉綠素、維生素 B₂ |
| 限制 | A > 0.01 才可偵測 | 需有螢光基團（或衍生化） |
兩個單色器：激發波長（λex）+ 發射波長（λem）各一
90° 偵測：最小化散射干擾，零背景效果
Pf = k·P₀·c：低濃度時線性；高濃度內濾效應使線性崩潰
量子效率 φ：發射光子數 ÷ 吸收光子數，越高越靈敏
λex 365 nm / λem 440 nm ppm → ppb 級偵測
λex 430 nm / λem 670 nm 植物食品品質鑑定
λex 450 nm / λem 520 nm 天然螢光，不需衍生
衍生後具螢光 蛋白質水解分析
① ε=5,000 vs 125,000：哪個靈敏？用多少 c 達到 A=0.5？
② 標準曲線第 6 點往下偏，可能原因？補救？
③ 橄欖油樣品含大量葉綠素干擾，如何設計 blank？
① 掃描 200–800 nm 全光譜，單光束或雙光束？為什麼？
② 窄狹縫讓 Beer's Law 更準，但有什麼副作用？
③ 咖啡因在 UV 275 nm，用玻璃槽可以嗎？
① 黃麴毒素為何選螢光而非 UV-Vis？靈敏度差從哪來？
② 橄欖油 vs 大豆油，用螢光法如何快速區分？
③ Pf = kP₀c 在高濃度線性崩潰，原因？如何驗證？
討論後全班報告 5 分鐘 | 參考答案：game_imports/wayground_ch7.txt
色素 ε = 3,800 L·mol⁻¹·cm⁻¹（at 510 nm），b = 1 cm，c = 2×10⁻⁴ mol/L
求：(a) A = ？ (b) %T = ？
解：A = εbc = 3,800 × 1 × 2×10⁻⁴ = 0.76
%T = 10^(2−A) = 10^(1.24) = 17.4%
量到 %T = 50%，b = 1 cm，c = 5×10⁻⁴ M
求：(a) A = ？ (b) ε = ？
解：(a) A = −log(0.5) = 0.301
(b) ε = A/(bc) = 0.301/(1×5×10⁻⁴) = 602 L·mol⁻¹·cm⁻¹
匯入：game_imports/gimkit_ch7.csv | 備用 Quizlet 格式：gimkit_ch7_quizlet.tsv
T = P/P₀ → 透光率
A = −logT → 吸光度
%T=50% → A=0.301
A 最佳範圍 → 0.2–0.8
A = εbc 各變數
ε 單位 → L/mol/cm
偏離原因①②③
校正曲線 r² → >0.999
UV 光源 → 氘燈
靈敏最高偵測器 → PMT
螢光角度 → 90°
黃麴毒素 → 365/440 nm
β-胡蘿蔔素 ε → 125,000
β-胡蘿蔔素 λmax → 465 nm
Bradford 波長 → 595 nm
Trp λmax → 278 nm
螢光靈敏 → UV-Vis 100–1000×
Pf 公式 → k·P₀·c
量子效率 φ → 發射/吸收光子
VitB₂ λem → 520 nm
UV 比色槽 → 石英
雙光束優點 → 補償漂移
Blank 作用 → 排除背景
標準添加法 → 補償基質效應
A = 2 − log10 = 2 − 1 = 1.0
吸光能力強 → 靈敏度高（非分子量大）
補償基質效應（非不需標準品）
避免激發光進入偵測器（非節省空間）
天然螢光，ppb 級偵測（非濃度高）
共軛越長 λmax 紅移 ε 越大（非沸點）
匯入檔：game_imports/kahoot_ch7.xlsx（題 12–17）
A = −logT = 2−log%T：吸光度是對數關係，A 正比於 c，%T 不是。
Beer's Law A = εbc 在稀溶液（<10 mM）且單色光條件下成立；高濃度或多色光會偏離。
最佳量測範圍 A = 0.2–0.8（15–65%T）：太高或太低都使相對誤差增大。
分光光度計五元件：光源→單色器→樣品槽→偵測器→讀出。雙光束自動補償光源漂移。
螢光光譜 90° 偵測，Pf = kP₀c，靈敏度比 UV-Vis 高 1000×，適合毒素、維生素等微量分析。
下次課程：紅外線光譜法（IR Spectroscopy）
Nielsen's Food Analysis, 6th Ed. · Chapter 7