從層析圖到濃度
HPLC 咖啡因定量互動教學

用真實的 HPLC 原始資料，一步步看懂：峰面積是怎麼積出來的、檢量線是怎麼建的、 以及一個未知樣品的濃度是怎麼被算出來的。所有圖都可以動手操作。

Shimadzu LabSolutions 原始匯出檔 6 個標準品 + 4 個樣品 280 nm · 注射 10 µL · 6 min

STEP 1定量的邏輯

HPLC 偵測器量到的是吸光訊號隨時間的變化，不是濃度。 要得到濃度，必須經過三個轉換。反相 HPLC 搭配紫外偵測（咖啡因在 272–280 nm 有強吸收） 是飲料與茶葉中咖啡因定量的標準做法[13,14]。

圖 1｜定量的三次轉換：訊號 → 面積 → 濃度。中間那條「檢量線」是唯一把儀器訊號翻譯成化學量的橋樑。
核心假設

面積正比於量

在偵測器線性範圍內，峰面積 ∝ 進入偵測器的分析物莫耳數。這是所有 HPLC 定量的前提。

為什麼用面積

面積比峰高穩健

峰形變寬（管柱老化、基質效應）時峰高會掉，但面積幾乎不變。本例樣品峰就明顯比標準品寬。

需要什麼

已知濃度的標準品

用一系列已知濃度跑出面積，建立「面積 = f(濃度)」的關係，再反推未知樣品。

STEP 2層析圖：原始訊號長什麼樣

每個檔案是 721 個點（每 0.5 秒一點，共 6 分鐘）。 咖啡因大約在 4.4–4.7 分鐘出峰（黃色區帶）。 把六個標準品疊在一起，會看到峰高隨濃度規律上升——這就是定量的直觀基礎。

圖 2｜互動層析圖疊圖。勾選要顯示的檔案；滑鼠移到圖上可讀取該時間點的訊號值。 注意 std-0（空白）在黃色區帶內完全沒有峰——這是判定該峰確實是咖啡因的重要佐證。
觀察重點

切到「放大咖啡因區」後同時勾選標準品與樣品，會發現樣品的峰比較早出、比較寬 （滯留時間 4.43–4.59 vs 標準品 4.65–4.68）。這是真實樣品的基質效應，屬正常現象； 只要峰型完整、能與鄰峰分開，面積積分就不受影響。

STEP 3基線校正：面積要從哪裡開始算

峰面積是「訊號減去基線」圍出來的，所以基線畫在哪裡，直接決定答案。 儀器的做法是把峰起訖兩點連一條直線；更通用的做法是 airPLS（自適應迭代重加權懲罰最小平方）[4]， 它不需要先知道峰在哪，靠迭代加權自動把「疑似基線」的點權重調高、把峰壓下去。

校正後訊號 = 原始訊號 − airPLS(原始訊號) ← 注意 airPLS() 回傳的是基線，不是校正後的訊號

唯一要調的參數是平滑度 λ：λ 越大基線越硬（趨近直線），λ 越小基線越軟 （能貼合起伏，但也可能爬進峰底下把峰當成基線吃掉）。下圖可以親手拖 λ 看這件事發生。

峰高保留—
檢量線斜率比—
檢量線 R²—
樣品濃度 (ppm)—

—

圖 3｜上圖是原始訊號（灰）與 airPLS 基線（紅）；下圖是扣掉基線後的訊號。 把 λ 拉到最小，會看到紅色基線鼓起來鑽進峰底下，下圖的峰跟著矮一截—— 那就是被當成基線吃掉的面積。λ 拉到最大則基線變成近乎水平線，跟不上真實起伏。
怎麼判斷 λ 挑對了

看峰高保留率（校正後峰高 ÷ 線性基線扣除後峰高）。低於 99% 表示基線 吃到峰；同時檢量線斜率也會跟著掉，等於整批訊號被系統性削弱。本資料的安全區間是 λ = 10⁴ ~ 10⁵、differences = 2。

λ 太大也會錯——而且更難發現

λ 太小的問題（吃掉峰）在圖上看得出來；λ 太大的問題是基線退化成水平線、跟不上真實漂移， 殘留的漂移會被算進面積。切到 sample-3 再把 λ 拉到 10⁷ 以上， 它的濃度會從約 86 ppm 跳到 92 ppm 以上，但層析圖上幾乎看不出異狀。

疊加已知漂移的回收測試

要客觀評估 λ，最好的方法是疊一個已知的基線漂移上去，看校正後面積變了多少。 理想的基線校正應該把疊加的漂移完全移除，面積不變（誤差 0%）。

檔案漂移型態
圖 4｜疊加漂移後的面積變化%（越接近 0 越好）。 λ = 10⁴ 對四種漂移形狀都控制在 2% 以內；λ ≥ 10⁵ 在「起伏型」基線上會嚴重失效。
結論：λ 沒有萬用值

λ = 10⁵ 在這批資料上與線性基線最接近（樣品濃度差 ≤ 0.34 ppm）， 因為這批的基線本來就很平；但它擋不住週期約 4 分鐘的起伏型基線。 基線只是平緩漂移用 10⁵；不確定就用 10⁴。 換一台儀器、換一個梯度程式，都應該重做一次這個測試。

那為什麼後面用的是另一種基線？

STEP 4 的 alignDE 內建 baselineCorrectionCWT，它同樣是 Whittaker 懲罰最小平方 [3]，差別在於它用 CWT 偵測到的峰區來決定哪裡該擬合， 而 airPLS 靠自適應加權自動判斷、不需先偵測峰。兩者在本資料算出的最終樣品濃度差 ≤ 1 ppm，可以互相替換。

STEP 4峰對齊：把漂移的滯留時間拉回來

上一步看到樣品的峰比標準品早出 0.06–0.23 分鐘。只要滯留時間會漂移， 就沒辦法用同一個固定的積分視窗處理所有檔案。 alignDE[1] 用小波峰型比對找出峰位、 再用差分演化搜尋每個峰該平移多少，把所有圖譜對到同一個參考圖上。

1 · 找峰

連續小波轉換

用 Mexican Hat 小波做 CWT 找峰頂（ridge line）[2]， 再用 Haar 小波估計每個峰的起訖點。

2 · 扣基線

懲罰最小平方

Whittaker 平滑[3]在非峰區擬合一條柔性基線並扣除， 讓相關係數不被基線漂移主導。

3 · 對齊

差分演化

DE[5,6] 搜尋每群峰在 ±slack 內的位移，最大化與參考圖的 相關係數；峰內不變形，峰間線性內插。

和其他對齊方法的關係

層析圖對齊最經典的方法是 COW（correlation optimised warping， Nielsen 等人 1998[7]）， 它把訊號切段後逐段伸縮；Tomasi 等人[8] 系統比較過 COW 與 DTW 在層析資料上的表現。alignDE 的差別在於只平移峰、不伸縮峰內部， 因此峰面積在對齊過程中被完整保留——這正是定量分析需要的性質[1]。

參考圖：—
圖 4｜同一批 10 個層析圖（已扣基線）在對齊前後的疊圖。切換按鈕看差別： 對齊前樣品（深色線）的峰散在 4.43–4.60 min；對齊後全部收攏到參考峰位 4.658 min。 峰高與峰形沒有改變——alignDE 只平移位置，不改變面積。

對齊診斷

檔案對齊前相關係數對齊後相關係數 峰頂前 (min)峰頂後 (min)與參考差 (min)

對齊到底買到了什麼

alignDE 依設計會保留峰面積，所以對齊本身不會改變面積。 它真正的價值是讓所有檔案能共用同一個固定積分視窗。 下表用不同寬度的固定視窗（以參考峰頂為中心）重跑定量：穩健的方法，答案不該隨視窗寬度大幅改變。

固定視窗半寬未對齊 (ppm) 對齊後 (ppm)
圖 5｜視窗寬度敏感度。未對齊時，視窗一縮小，樣品的峰就有一半落在視窗外， 濃度崩跌（sample-1 從 92.6 掉到 47.1 ppm）；對齊後同樣的視窗變化只造成幾 ppm 的差異。
結論

各樣品在 ±0.20 ~ ±0.50 min 五種視窗下的濃度全距平均：未對齊 27.3 ppm → 對齊後 4.7 ppm。 對齊讓定量結果不再依賴「積分視窗剛好設對」這件事。

對齊不是萬能

alignDE 是訊號層級的校正，它假設要對齊的峰確實是同一個化合物。 如果峰的身分本來就判斷錯了（見 STEP 7），對齊只會把錯的峰對得更整齊。 另外空白樣品（std-0）在該區間沒有峰，對齊對它沒有意義——表中它的相關係數維持在 0 附近。

STEP 5峰積分：面積是怎麼算出來的

「峰面積」＝ 訊號曲線與基線之間圍出的面積。 電腦的做法是把這塊區域切成很多細長梯形再加起來（梯形法）。 下面可以親手拖曳積分起訖點、調整梯形數量，看面積怎麼變。

積分區間—
梯形法面積（目前梯形數）—
全解析度面積（721 點）—
儀器報告面積—
與儀器差異—

拖曳圖上兩條虛線把手（▮）可改變積分起訖點；灰色斜線是基線，由起訖兩點連成。

圖 6｜峰積分互動示範。梯形數愈多，梯形法的結果愈接近真值；本例約 30 個梯形就已收斂到 0.1% 以內。
面積 ≈ Σ [ (hi + hi+1) / 2 ] × Δt　　h = 訊號 − 基線，Δt = 0.5 秒
基線與積分邊界會直接改變答案

把起點往左拉、終點往右拉，面積會不斷變大——因為多含進了基線雜訊與鄰峰。 這也是為什麼標準品與樣品必須用一致的積分規則，否則檢量線本身就失真了。

STEP 6檢量線：把面積翻譯成濃度

六個已知濃度的標準品各得到一個面積，把（濃度, 面積）畫成散布圖做最小平方線性迴歸， 就得到檢量線。下圖可切換是否納入空白點、是否強制過原點，即時看係數與 R² 怎麼變。

—
斜率 b（靈敏度）—
截距 a—
判定係數 R²—
迴歸標準誤 s—
LOD = 3.3 s/b [10,11]—
LOQ = 10 s/b [10,11]—
圖 7｜檢量線與殘差圖。上圖的點若目視「都在線上」不代表沒問題， 必須看下方殘差圖：殘差應隨機分布在 0 上下；若呈現系統性的 ∪ 或 ∩ 形，表示響應其實不是線性的。

殘差在說什麼

本例殘差呈現淺淺的 ∪ 形（低濃度與高濃度偏正、中間偏負），代表響應有輕微正曲率： 每 ppm 的面積從 43,222 慢慢升到 48,154。改用二次式擬合可讓 R² 從 0.999435 升到 0.999861—— 提升僅 0.0004，不足以放棄線性模型的簡潔，故仍採線性。

R² 高不等於方法正確

R² = 0.9994 看起來很漂亮，但它只說明「點靠近線」。真正該檢查的是： 殘差是否隨機、各標準品回算濃度是否落在標稱值 ±5% 內、樣品是否落在檢量線範圍內。 本例回算濃度誤差為 −1.7%～+3.1%，通過。IUPAC 的單成分檢量線指引[9] 與 ICH Q2 確效規範[11] 對線性、範圍與 LOD/LOQ 的評估都有明確要求。

STEP 7樣品定量：反推未知濃度

樣品的面積落在 y 軸上，往右水平走到檢量線，再垂直落下來讀 x 軸，就是濃度。 點下方按鈕看動畫演示。

峰面積—
濃度—
95% 信賴區間—
是否在檢量線範圍內—
圖 8｜反推示意。灰色帶是檢量線的 95% 預測區間——它在中心濃度處最窄、兩端最寬， 所以樣品濃度盡量落在檢量線中段，結果最可靠。
C (ppm) = ( Area − a ) / b　　　不確定度 sC = (s / b) √( 1 + 1/n + (C − C̄)² / Sxx )

反推濃度的標準誤公式與 95% 信賴區間的推導見 Miller & Miller [12]；n 為檢量線點數，C̄ 為標準品濃度平均， Sxx = Σ(Ci − C̄)²。

STEP 8陷阱：不要盲信儀器的自動判峰

這批真實資料裡，儀器的自動化合物指認在 4 個檔案是錯的。 它照著方法檔設定的滯留時間視窗抓峰，但樣品滯留時間漂移後，它就抓到旁邊的雜訊小峰。

圖 9｜紅色箭頭是儀器指認的「咖啡因」，綠色箭頭是真正的咖啡因峰。兩者面積差了 190 倍。
檔案儀器指認 RT儀器指認面積實際咖啡因 RT實際面積若照用儀器結果
std-254.177174,9854.6531,080,560檢量線嚴重偏低
sample-1未指認—4.4464,378,116無結果
sample-33.24221,3554.5944,085,132−0.24 ppm（負值）
sample-44.02817,6364.5784,114,384−0.33 ppm（負值）
怎麼避免

① 每次分析都親眼看層析圖，不要只看報表數字。
② 用空白（std-0）確認該滯留時間確實沒有干擾峰。
③ 出現負濃度、或濃度與峰高明顯矛盾時，一定是判峰或基線出了問題。

STEP 9最終結果

檢量線

Area = 48,393.42 × C − 111,613.06　　R² = 0.999435　(n = 6)
C (ppm) = ( Area + 111,613.06 ) / 48,393.42

樣品濃度

樣品滯留時間 (min)峰面積濃度 (ppm)95% CI檢量線範圍內
單位與稀釋

濃度單位與標準品配製單位相同（ppm = µg/mL）。本批 Dilution Factor = 1、注射量 10 µL 全部一致； 若前處理有稀釋，最終結果需再乘上稀釋倍數。

三句話總結

面積

訊號減基線再積分

基線畫在哪、積分從哪開始到哪結束，直接決定面積大小；標準品與樣品必須一致。

檢量線

看殘差不只看 R²

R² 0.999 仍可能有系統性曲率。回算濃度與殘差圖才是真正的驗收指標。

判峰

眼睛看過層析圖

自動指認會因滯留時間漂移而抓錯峰。負濃度就是最明顯的警訊。

參考文獻References

以下文獻對應本頁實際使用的演算法與規範。第 1–10、13–14 項的書目資料 已透過 Crossref 以 DOI 逐筆核對；第 11–12 項為法規指引與教科書，無 DOI。

A · 峰對齊與訊號前處理

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  2. [2] Improved peak detection in mass spectrum by incorporating continuous wavelet transform-based pattern matching. Du P., Kibbe W. A., Lin S. M. (2006). Bioinformatics, 22(17), 2059–2065. 10.1093/bioinformatics/btl355 CWT ridge-line 峰偵測演算法；alignDE 的 cwt()、getRidge()、 identifyMajorPeaks() 改寫自此方法（MassSpecWavelet）。
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B · 檢量線、偵測極限與方法確效

  1. [9] Guidelines for calibration in analytical chemistry. Part I. Fundamentals and single component calibration (IUPAC Recommendations 1998). Danzer K., Currie L. A. (1998). Pure and Applied Chemistry, 70(4), 993–1014. 10.1351/pac199870040993 單成分檢量線的建立、線性檢驗與殘差評估的 IUPAC 規範。
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C · 咖啡因的 HPLC 定量

  1. [13] Determination of caffeine in beverages by high performance liquid chromatography. DiNunzio J. E. (1985). Journal of Chemical Education, 62(5), 446. 10.1021/ed062p446 以反相 HPLC + UV 外標法定量飲料中咖啡因的教學實驗，與本頁流程相同。
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軟體

軟體版本用途
R4.6.1檢量線迴歸、峰對齊
alignDE3.0.0CWT 峰偵測、基線扣除、DE 對齊
DEoptim2.2.8差分演化最佳化引擎
Python3.12解析、迴歸、繪圖、產生本頁
NumPy / SciPy / pandas / Matplotlib—數值計算與繪圖