食品分析實驗 · W5

蛋白質凱氏定氮法

Protein — The Kjeldahl Method

食品分析實驗　·　4 小時課程
消化 · 蒸餾 · 滴定 · 換算係數 · 三聚氰胺事件 · 回收率 QC

濃 H₂SO₄ 消化40% NaOH 蒸餾4% 硼酸捕氨係數 5.7/6.25/6.38三聚氰胺事件

課前導覽影片（2 分半）

上課前先看：一顆氮原子怎麼變成「蛋白質 26%」這個數字？

內容：① 消化（濃 H₂SO₄＋觸媒錠，氮 → NH₄⁺）→ ② 蒸餾（NaOH、NH₃ 落進硼酸）→ ③ 滴定（1 HCl ＝ 1 NH₃ ＝ 1 N）→ %N × 6.38 ＝ 26.0%；三聚氰胺走同一條路；係數要選對。　在 YouTube 開啟 →

開始前，先看兩支工廠影片

凱氏法量的到底是氮，還是蛋白質？

奶粉工廠（16:54–18:08，三聚氰胺事件——蛋白質檢測是怎麼被騙的）麵粉工廠（15:11–16:14，NIR 同時測蛋白質/水分/灰分，8–13% 蛋白質決定做麵包還是蛋糕）

今天的關鍵問題：凱氏法（跟後面會提到的 Dumas 燃燒法一樣）其實只測得到「總氮量」，再用一個換算係數把氮換成「蛋白質」——這個假設什麼時候會出錯？三聚氰胺（melamine）事件就是最有名的一次。

先算一個數字記在心裡： 三聚氰胺 %N ≈ 66.6%，若混入 1 g / 100 g 樣品，表觀蛋白質(用總氮×係數算、未扣非蛋白氮的數字；以乳品係數 6.38 計)會虛增約 4.25 個百分點——等一下我們一起重新算一次。

互動實驗室

一個氮的旅程：預測 → 觀察 → 解釋

六幕：預測 → ① 消化 → ② 蒸餾 → ③ 滴定 → 三聚氰胺 → 換算係數；每幕看完答對才能下一幕。另開實驗室 ↗

今天的學習目標

上完 W5，你應該會…

說出凱氏定氮法的三個階段：消化、蒸餾、滴定，以及各自的目的
分辨蛋白質氮與非蛋白氮(NPN)，並解釋為什麼三聚氰胺能騙過凱氏法
選對換算係數（一般 6.25／小麥穀類 5.7／乳品 6.38），並知道選錯會造成多大誤差

用 %N=(V_樣品−V_空白)×N_HCl×14.007/W×100 算出樣品的 %N 與蛋白質%
說出蒸餾回收標準品(硫酸銨)與消化效率標準品(胺基酸)分別在檢查什麼
遵守濃硫酸／NaOH 相關安全規範，並完成 4 小時的分工與輪站

理論複習：蛋白質定性/定量方法的完整原理，本課不重複——完整內容在 📖 完整原理 deck (Nielsen Ch18) → 那份教材。

原理：三階段

消化 → 蒸餾 → 滴定

關鍵一句：硼酸本身不需要標定——它只負責「捕捉」NH₃，真正用來定量的是後面已標準化的 HCl。
觸媒錠的兩個角色：K₂SO₄ 提高硫酸沸點（使消化溫度可達約 420°C）；CuSO₄ 為觸媒，加速有機物氧化分解。　📖 完整原理 deck (Nielsen Ch18) →

裝置圖

消化爐與蒸氣蒸餾儀

蒸餾時接收瓶的出口要浸在硼酸液面下，NH₃ 才不會逸散；蒸餾結束先把接收瓶放低、讓出口離開液面，再關蒸氣，避免倒吸。示意圖，實際外觀依廠牌而異。

蛋白質 = %N × 換算係數

凱氏法量的是「總氮」，不是「蛋白質」

換算係數	適用	理由(簡述)
6.25	一般食品(通用值)	假設蛋白質平均含氮 16%（1/0.16=6.25）
5.7	小麥／穀類	穀類蛋白麩質含氮比例較高，需用較小係數
6.38	乳品	酪蛋白等乳蛋白含氮比例較低，需用較大係數

凱氏法(與 Dumas 燃燒法一樣)量的是「總氮」，包含蛋白質氮，也包含非蛋白氮(non-protein nitrogen, NPN)——例如三聚氰胺、尿素、游離胺基酸、核酸等。換算係數是「假設氮全部來自蛋白質」下的近似值，一旦樣品混了高氮的非蛋白物質，算出來的「蛋白質%」就會被虛增。
Dumas 燃燒法：把樣品在高溫下完全燃燒，直接測氮氣量，比凱氏法快(數分鐘 vs 數小時)，但一樣測的是總氮、一樣會被 NPN 干擾——本次實驗不做，僅供比較認識。
註：小麥/穀類的 5.7，是 Jones/Codex 沿用已久的傳統換算係數。

小遊戲 ①這個氮，算不算「蛋白質氮」？0 / 8

把 8 個氮的來源分到「蛋白質氮」或「非蛋白氮 (NPN)」。

重新算一次

三聚氰胺事件：為什麼凱氏法會被騙？

三聚氰胺 (melamine, C₃H₆N₆)：MW=126.12，含氮量高達 66.63%

正常牛奶的氮幾乎全來自酪蛋白等乳蛋白(蛋白質氮)
不肖業者把水稀釋過的奶粉，故意加入三聚氰胺——它不是蛋白質，但氮含量極高
凱氏法只看「總氮」，分不出這個氮是蛋白質來的還是三聚氰胺來的

算給你看：每混入 1 g 三聚氰胺 / 100 g 樣品(即 1% w/w)：
貢獻的 %N = 1% × 66.63% ≈ 0.6663 個百分點
以乳品係數 6.38 換算，虛增的表觀蛋白質 ≈ 0.6663 × 6.38 ≈ 4.25 個百分點

也就是說：只要摻入約 1% 的三聚氰胺，凱氏法測出的「蛋白質%」就能被拉高 ~4.3 個百分點——足以把稀釋摻水、蛋白質本來不足的奶粉，偽裝成「合格」。

事件重建・示意數據

摻偽曲線：三聚氰胺混入比例 vs 表觀蛋白質

示意數據：以全脂奶粉(真實蛋白質約 26.0%)為基準，x 軸為三聚氰胺混入比例(% w/w，等距)，y 軸為凱氏法測出的表觀蛋白質%。曲線之所以是直線上升，是因為凱氏法無法分辨氮的來源。

校正與品管 (QC)

開始前／過程中要確認的 4 件事

⚗️

HCl 標定

滴定用的 HCl 須先用 Na₂CO₃ 或 THAM(Tris)等一級標準品標定出精確濃度，才能拿來換算 %N

🧪

試劑空白 (blank)

空管走完整套消化＋蒸餾＋滴定流程(不加樣品)，扣除試劑本身帶入的微量氮

♻️

蒸餾回收標準品

用已知氮量的硫酸銨(理論 %N=21.20%)走蒸餾＋滴定，檢查 NH₃ 有沒有被完全蒸出、捕捉

🔬

消化效率標準品

用離胺酸鹽酸鹽或色胺酸等有機氮標準品走全流程，檢查消化階段是否把有機氮完全轉化

校正與品管 (QC)

算給你看：回收率與終點判讀

算給你看(蒸餾回收)：秤 0.0500 g 硫酸銨(理論%N=21.20%)，走蒸餾＋滴定測得 %N=21.01%，回收率 = 21.01/21.20×100 ≈ 99.1%（AOAC 991.20：硫酸銨 ≥99%、離胺酸鹽酸鹽 ≥98%）。
算給你看(消化效率)：離胺酸鹽酸鹽理論%N=15.34%，走全流程測得%N=15.10%，回收率≈98.4%。這兩個標準品本學期先由 TA 示範一管，讓全班理解原理，未列入下方 8 管的分組排程。

指示劑終點一致性：全班用同一批 4% 硼酸＋混合指示劑，滴定終點要一致：吸收 NH₃ 後接收液呈綠色，以 HCl 滴到綠色褪去、轉為灰紫/淡粉紅即為終點，避免組間判讀落差。

樣品與輪站分工

一套凱氏設備（消化爐 + 蒸餾儀），只能容納 8 管

盲樣：全學期共同的全脂奶粉——W2 測過水分、W3 測過灰分，本週測蛋白質。5 組各消化 1 管盲樣，全班湊成 n=5（每組貢獻一個值），彙整成平均值 ± SD
另外 3 管為品管與比較用：1 管試劑空白、1 管蒸餾回收標準品(硫酸銨)、1 管高筋麵粉——高筋麵粉這管由 1 組代表操作，結果全班共用
低筋(蛋糕)麵粉的結果由助教提供(前一次操作的數據)，用來跟高筋麵粉比較——本次消化爐排程已滿 8 管，無法再現場加測
消化效率標準品(離胺酸鹽酸鹽)仍由 TA 示範一管，不占用班級排程
合計：5(盲樣) ＋ 1(空白) ＋ 1(回收標準品) ＋ 1(高筋麵粉) = 8 管

⚠️ 請 TA 開課前務必確認：消化爐與蒸餾儀確實能容納 8 管同時排程——本排程剛好把 8 管的容量用滿，沒有多餘空間，若設備容量不足 8 管，需提前調整分組或分批消化。

只有一套設備：所有管子一起消化，再依序輪流蒸餾＋滴定，每管約 8–10 分鐘。

4 小時課程時間表

消化集中進行，蒸餾滴定輪站

時間	內容
0:00–0:20	講解＋安全：濃硫酸、NaOH 危害與應變
0:20–0:50	各組秤樣，加入催化錠與濃硫酸(於通風櫃內操作)
0:50–2:20	消化(全部 8 管一起加熱至澄清)——空檔進行換算係數討論、三聚氰胺案例、計算練習
2:20–2:35	冷卻至室溫後，沿管壁緩慢少量加水稀釋
2:35–4:00	蒸餾＋滴定輪站：8 管 × 每管約 8–10 分鐘 ≈ 65–80 分鐘，85 分鐘的時段足夠，各組記錄自己樣品的滴定體積

若時間不夠：已消化完成的管子可加蓋暫存，由 TA 於課後或下週協助完成蒸餾與滴定，不影響消化階段已完成的化學反應。

安全守則

濃硫酸 · NaOH · 廢液

🥽

濃硫酸高溫＋白煙

消化產生 SO₂/SO₃ 刺激性氣體，全程在通風櫃/洗滌塔下操作；配戴面罩與耐酸手套

💧

稀釋要沿管壁緩慢加水

冷卻至室溫後，才能沿管壁緩慢、少量加水稀釋，切勿大量快速加水——否則劇烈放熱會噴濺灼傷

⚠️

40% NaOH 具強腐蝕性

蒸餾時加入的 NaOH 濃度高，沾到皮膚/眼睛立即大量清水沖洗並通知助教

♻️

銅觸媒廢液分開收集

消化後含銅廢液屬重金屬廢液，須依規定分開收集，不可與一般廢液混合

小遊戲 ②凱氏定氮法操作流程排序— / 7

用 ▲▼ 把凱氏定氮法的 7 個步驟排成正確順序。

小遊戲 ③食品配對它的換算係數0 / 6

把 6 種食品分到它應該使用的「換算係數」。

計算：從滴定量到 % 蛋白質

先扣空白，再乘換算係數

%N = (V_樣品 − V_空白) × N_HCl × 14.007W_樣品(g) × 1000 × 100　　蛋白質% = %N × 換算係數

每 1 mmol HCl ↔ 1 mmol NH₃ ↔ 1 mmol N = 14.007 mg N；÷(W×1000) 把 mg 換成 g、×100 成為 %。

全脂奶粉(盲樣)範例：秤 0.5000 g，空白 0.30 mL，滴定用去 14.86 mL，0.1000 N HCl
%N = (14.86−0.30)×0.1000×14.007/(0.5000×1000)×100 ≈ 4.079%
蛋白質% = 4.079 × 6.38 ≈ 26.02%（乳品係數）

高筋麵粉範例(全班共用的那一管)：秤 1.0000 g，空白 0.30 mL，滴定用去 16.58 mL，0.1000 N HCl
%N ≈ 2.280%；蛋白質%(係數5.7) = 2.280×5.7 ≈ 13.00%

⚠️ 係數選錯的代價：同一份高筋麵粉的 %N，若誤用一般係數 6.25 而非小麥係數 5.7，算出的蛋白質% 會從 13.00% 變成 14.25%——虛高約 9.6%（相對誤差），這是一種系統性誤差(systematic error)，跟三聚氰胺一樣，都跟「氮不等於蛋白質」這個假設有關，只是原因不同(選錯係數 vs 樣品被摻偽)。
低筋(蛋糕)麵粉%N≈1.404%，蛋白質%(係數5.7)≈8.00%——本次由助教提供(前次操作數據)，本班未現場加測這一管，比高筋麵粉低，這正是烘焙時「高筋做麵包、低筋做蛋糕」的依據。

小遊戲 ④計算闖關：全脂奶粉的蛋白質 %未作答

秤 0.5020 g 全脂奶粉，試劑空白 0.32 mL，滴定用去 15.02 mL 的 0.1000 N HCl。求蛋白質 %（乳品換算係數 6.38）。公式：%N=(V樣品−V空白)×N×14.007/(W×1000)×100，蛋白質%=%N×6.38。

小遊戲 ⑤凱氏法原理即時測驗0 / 5

小遊戲 ⑥決策挑戰：QC 與判讀0 / 5

課後作業

Colab NB05

📥

讀入滴定紀錄

載入本組與全班的滴定體積、樣品重量原始資料

🧮

算 %N 與蛋白質%

兩種麵粉＋盲樣：計算 %N、蛋白質%，並彙整全班盲樣的平均值 ± SD(n=5)

♻️

回收率與係數討論

討論蒸餾回收率、消化效率標準品的意義，以及選錯換算係數/遇到 NPN 的影響

Colab NB05：在 Colab 開啟 NB05 ↗　・入門（不用寫程式）：Excel 練習檔 EX05 ⬇。
報告需包含：兩種麵粉與盲樣的 %N、蛋白質%（盲樣為全班平均值 ± SD）、蒸餾回收率、以及對「換算係數」與「非蛋白氮」的討論。
盲樣結果留著別丟：本週測得的全脂奶粉蛋白質%，將在 W8 與水分(W2)、灰分(W3) 一起彙整回顧。

自我檢核

今天結束，你應該會…

✓說出凱氏定氮法的三個階段：消化、蒸餾、滴定，以及各自的目的
✓解釋為什麼凱氏法量到的是「總氮」而不是「蛋白質」，並區分蛋白質氮與非蛋白氮(NPN)
✓重新計算三聚氰胺事件：混入多少比例會虛增多少表觀蛋白質
✓選對換算係數(一般6.25／小麥穀類5.7／乳品6.38)，並說出選錯的後果
✓用 %N 公式從滴定體積算出樣品的 %N 與蛋白質%
✓說出蒸餾回收標準品(硫酸銨)與消化效率標準品(胺基酸)分別在檢查什麼
✓完成一次凱氏定氮法的分組操作(消化＋蒸餾＋滴定)
✓遵守濃硫酸／NaOH 相關的安全守則

點一下打勾——確認自己真的會了。

蛋白質 凱氏定氮法