食品分析實驗 · W10
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食品分析實驗 · W10

振動光譜原理與光譜儀校正

Vibrational Spectroscopy (NIR vs Raman) & Spectrometer Calibration
食品分析實驗　·　4 小時課程
NIR 五種機型輪組固定 · 532/785nm 拉曼兩台輪流 · 校正 · 純物質光譜 → 班級光譜庫
NIR overtone/combinationRaman shift矽晶圓/聚苯乙烯校正白參考/暗電流螢光背景
開始前，先看一段工廠影片
工廠用 NIR，幾秒鐘就「量出」蛋白質？

麵粉工廠 NIR 產線（15:11–16:14，幾秒內同時報告蛋白質/水分/灰分）↗

先想一想：NIR 儀器螢幕上跳出的「蛋白質 12.3%」，是直接量到蛋白質分子嗎？ 還是量到別的東西、再換算出來的？如果是換算，換算的依據是什麼？——這堂課會回答這個問題， 也是為什麼這門課的前半學期都在教凱氏法等「參考方法」的原因。

今天的任務： 搞懂 NIR 與 Raman 兩種振動光譜的原理差異，把自己組的儀器校正好， 再量出一批純物質光譜——這些光譜會變成整個班級共用的光譜庫， 也是 W15–16 甜味劑專題的參考資料。

今天的學習目標

上完 W10，你應該會…

  • 說出 NIR 訊號來自 X–H 鍵的倍頻與合頻(overtone/combination)，為什麼寬又重疊、需要化學計量學
  • 說出 Raman 訊號來自非彈性散射，理解 Raman shift(cm⁻¹) 的定義，以及為什麼圖譜像指紋一樣尖銳
  • 解釋為什麼水是 NIR 的強吸收體，卻是 Raman 很弱的散射體
  • 說出為什麼有色/易螢光樣品常改用 785nm，而 532nm 散射訊號較強、但螢光背景也較大
  • 看懂波長(nm) ↔ 波數(cm⁻¹)換算，並說出穿透吸光度 A、漫反射 R 如何由暗電流／白參考算出
  • 完成 Raman x 軸校正(矽晶圓、聚苯乙烯)，並記錄兩台雷射各自的校正結果
  • 完成 NIR 暗電流／白參考／波長檢查，並認出 InnoSpectra 卡匣正反裝造成的基線異常
  • 完成 5 次重複掃描，看懂平均光譜與 SD 光譜、判斷雜訊最大的位置
  • 遵守雷射安全與溶劑操作規範，量出本組的純物質光譜並依規則命名上傳

理論複習：本課不重複紅外光譜、光譜學的完整原理——完整內容在 📖 完整原理 deck（Nielsen Ch8，紅外光譜）→ 與 📖 完整原理 deck（Nielsen Ch6，光譜學總覽）→。

光譜學速成

波長(nm)、波數(cm⁻¹)、能量：三個互相換算的量

ν̃ (cm⁻¹) = 10⁷ / λ(nm) 　　E = hc/λ
  • 換算範例：λ=1450 nm → ν̃ ≈ 6897 cm⁻¹；λ=785 nm → ν̃ ≈ 12739 cm⁻¹（同一段光只是換一種刻度來描述，波長跟波數方向相反：波長變大、波數變小）
  • 今天的範圍：近紅外(NIR) 780–2500 nm ≈ 12800–4000 cm⁻¹；中紅外(MIR) 2.5–25 µm(2500–25000 nm) = 4000–400 cm⁻¹——今天量的 NIR、之後的 Raman，全都活在這個換算系統裡
  • E=hc/λ：h 是普朗克常數、c 是光速、λ 是波長；波長越短(波數越大)，光子能量越高——這在下面講拉曼螢光問題時會用到（785nm 光子能量比 532nm 低）
波長(nm) 與波數(cm⁻¹)：同一段光，兩種刻度 400 nm 780 nm 2500 nm 25000 nm(25µm) 可見光Vis 近紅外 NIR（今天量測的範圍） 中紅外MIR（基頻） 785 nm ≈ 12739 cm⁻¹ 1450 nm ≈ 6897 cm⁻¹ 25000 ≈12800 4000 400 上排：波長(nm)　下排：波數(cm⁻¹) ＝ 10⁷ / 波長(nm) 波長 λ 越長 ⇔ 波數 ν̃ 越小 ⇔ 光子能量 E=hc/λ 越低
原理

分子振動＝彈簧：為什麼會有倍頻／合頻

  • 把化學鍵想成一根彈簧：原子沿著鍵長方向來回振動，但量子力學只允許特定的振動能階(v=0,1,2,3…)
  • 基頻(fundamental，v=0→1)訊號最強，落在中紅外(MIR)；真實分子不是完美彈簧(非諧振 anharmonic)，所以 v=0 也有小機率直接跳到 v=2、v=3——這就是第一倍頻(≈2ν)、第二倍頻(≈3ν)，以及兩種振動模式加起來的合頻(ν₁+ν₂)，恰好落在 NIR
  • 每往上跳一階，訊號強度大約再弱 10–100 倍——這正是 NIR 吸收本身很弱、光可以穿進樣品幾毫米深、不需稀釋、幾乎無破壞的原因；X–H 鍵(氫最輕)振動頻率最高、非諧振效應也最明顯，所以它們的倍頻／合頻剛好落在 NIR 範圍內
非諧振彈簧：基頻、第一倍頻、第二倍頻 v=0（基態） v=1 v=2 v=3 基頻 v0→1中紅外・訊號最強 第一倍頻 v0→2 (≈2ν)NIR・弱10–100倍 第二倍頻 v0→3 (≈3ν)NIR・更弱
NIR 量什麼

兩種量測模式：穿透 vs 漫反射

💧
穿透 transmission（液體樣品）
光直接穿過樣品，量入射光 I₀ 與穿出光 I：
A = log₁₀(I₀/I) = εbc（跟 W07 ↗ 學過的吸光度公式同一套 Beer-Lambert 定律，只是換成 NIR 波長；ε=莫耳吸光係數、b=光徑長、c=濃度）
🧂
漫反射 diffuse reflectance（粉末／不透光樣品）
光打進粉末表面被反覆散射，偵測器收到的訊號換算成反射率：
R = (樣品−暗) / (白−暗)；粉末沒有單一光徑長，所以用表觀吸光度 A = log₁₀(1/R) 代替真正的吸光度，供化學計量學建模用
「暗(dark)」與「白(white)」怎麼量、多久量一次，下面「校正 2」會實際操作一次。
原理（簡述）

NIR：倍頻/合頻　vs　Raman：非彈性散射

  • NIR：訊號來自 O–H、C–H、N–H 等 X–H 鍵的倍頻/合頻——如 O–H(~1450、~1940 nm)、C–H(~1150–1210、~1700–1760 nm)。峰寬又重疊，一定要靠化學計量學才能定量；水是很強的吸收體，常主導光譜；非破壞、幾秒完成，常用於產線即時檢測
  • Raman：雷射照射樣品後的非彈性散射，出射光與入射光的波數差就是 Raman shift(cm⁻¹)，圖譜尖銳如指紋，可直接比對資料庫辨識物質
  • 水是很弱的 Raman 散射體，幾乎不干擾——這是量水溶液樣品的一大優勢；最大的敵人是螢光背景(下一頁細講)
  • 圖中的虛擬態(virtual state)＝雷射光子與分子短暫交互作用時的一個「非真實」能階——分子不會真的停留在這裡，只是量子力學描述那瞬間交互作用的說法
彈性散射(Rayleigh) vs 非彈性散射(Stokes Raman)：能階示意圖 虛擬態 virtual state v=1(振動激發態) v=0(基態) hν0 hν0 Rayleigh（彈性，同能量） hν0 h(ν0 − νvib) hνvib Stokes Raman（非彈性，分子留在 v=1） Raman shift Δν̃ = 入射與散射光的波數差(cm⁻¹)＝振動能階差，與雷射波長無關
原理

拉曼的兩個麻煩：訊號太弱與螢光蓋台

🎲
拉曼本來就很稀有
入射光子每 10⁶–10⁸ 個，大約只有 1 個會發生非彈性(拉曼)散射，其餘幾乎都是彈性散射(Rayleigh)或直接穿透——拉曼訊號天生就很微弱
📉
強度 ∝ 1/λ⁴
散射強度跟雷射波長的四次方成反比：(785/532)⁴ ≈ 4.7 → 同樣條件下，532nm 雷射給的拉曼訊號大約是 785nm 的 4.7 倍
🔥
螢光(fluorescence)＝真的吸收再放光
樣品電子真的吸收光子躍遷到激發態，再放出寬頻螢光，強度可比拉曼訊號強上千倍，把拉曼峰完全蓋掉——跟拉曼的散射完全是兩種現象
🔻
785nm 光子能量較低
E=hc/λ：波長越長、光子能量越低，較不容易把電子推上激發態，因此較不易引發螢光——這就是深色/易螢光樣品常改用 785nm 的原因，即使訊號本身較弱
小遊戲 ①這個特性屬於 NIR 還是 Raman？0 / 8
把下面 8 個敘述，分到「NIR 特性」或「Raman 特性」。
數據・模擬光譜

模擬拉曼光譜：532nm vs 785nm，同一組峰位置

示意數據/模擬光譜（非本班實測），x 軸為等間距的 Raman shift(cm⁻¹)。532nm 的散射訊號本身較強，但螢光背景也大幅升高、把小峰蓋掉；785nm 背景平坦，峰形清楚——這就是有色/易螢光樣品常改用 785nm 的原因。深色、含共軛色素（焦糖色素、類胡蘿蔔素、葉綠素）的樣品最易產生螢光；白色結晶、無色透明液體干擾小。
數據・模擬光譜

模擬 NIR 吸收光譜：水 vs 乙醇

示意數據/模擬光譜，非特定儀器規格。水的兩個峰約落在 1450 nm(O–H 第一倍頻)與 1940 nm(O–H 合頻)附近；乙醇除了較弱的 O–H 峰，還多了 C–H 第一倍頻 ~1700–1760 nm 與 C–H 第二倍頻 ~1150–1210 nm —— 這也是為什麼光看『某個波長的吸光值』很難分辨兩者，要靠整條光譜的形狀(化學計量學)。
承先啟後

化學計量學是什麼？──W11–W16 路線圖

  • 化學計量學(chemometrics)＝用統計方法，從一大堆(多變量)光譜數字中，萃取出跟化學成分/性質有關的資訊
  • 光譜本身只是一堆數字(強度 vs 波長/波數)，儀器並不知道「這是蛋白質」——一定要先用參考方法(如凱氏法測蛋白質W5 凱氏法 ↗、滴定測酸度W4 滴定 ↗)量出真正的數值，讓統計模型學習「光譜形狀」與「這個數值」之間的關係，這叫校正(calibration)
  • 接下來六週：前處理清乾淨光譜 → PCA 先看資料長什麼樣 → PLS 建定量模型 → VIP/分類/離群偵測 → 用實驗設計(DOE)規劃樣品 → 挑戰混合物解析
W11–W16 路線圖：從一堆光譜數字，走到能定量、能分類的模型 W11 前處理(雜訊/基線/正規化) W12 PCA(先看資料結構) W13 PLS(建立定量模型) W14 VIP／分類／離群偵測 W15 DOE(甜味劑實驗設計) W16 混合物解析(甜味劑定量)
校正 1

Raman x 軸校正：矽晶圓・聚苯乙烯・環己烷

💎
矽晶圓 Silicon wafer
單一尖峰 ~520.7 cm⁻¹，檢查峰位置是否落在儀器容許誤差內——x 軸校正最常用的基準
🧴
聚苯乙烯 Polystyrene
主要校正峰 1001.4 cm⁻¹(環呼吸模)，另有 620.9、1031.8、1602.3 cm⁻¹可交叉核對多點
🧪
環己烷 Cyclohexane
801.3 cm⁻¹等峰，依 ASTM E1840 拉曼位移標準品規範使用
ASTM E1840＝拉曼位移標準品規範，列出矽晶圓／聚苯乙烯／環己烷等公認峰位置，讓不同儀器對齊同一套波數刻度。532nm 與 785nm 是兩台雷射，要分別各做一次 x 軸校正，並記錄雷射功率與對焦狀態(功率過高可能燒焦/降解樣品，對焦不良會使訊號變弱)。
校正 2a

NIR：暗電流・白參考・波長檢查

  • 暖機時間：依儀器建議，讓光源與偵測器穩定後再開始量測
  • 暗電流(dark current)：光路全暗時的偵測器背景訊號，每次校正的第一步
  • 白參考(white reference)：如 Spectralon/PTFE(~99% 反射率)，每次上機前/每批樣品前都要重新做，建立反射基準
  • 波長檢查：用聚苯乙烯或 NIST 稀土氧化物反射標準品(如 SRM 1920 系列，若有)確認波長準確性
  • 量已知光譜：如水，確認基線與波形正常，才開始量未知樣品(下一頁看一個真實的反面教材)
R = (樣品−暗) / (白−暗)　　A = log₁₀(1/R)
校正 2b

一個真實的 QC 教訓：InnoSpectra 卡匣正反裝

InnoSpectra NIR-M-T1＋1 mm 石英槽＋黑色 U 形支架：正裝 vs 反裝（側視） NORMAL 正裝（錯誤）：支架底座在下 光源端 偵測器 ✕ 黑支架厚底座 沉入光路槽擋光 1 mm 石英槽 光束打在底座 → 基線升高、水峰消失 INVERTED 反裝（正確）：支架倒扣 光源端 偵測器 支架翻轉倒扣 （底座朝上＋彈片） 1 mm 石英槽 下半部裸露透光 石英槽對準光束 → 光譜正常、峰形完整 QC 習慣：不管正裝反裝，開始量測前先量一次已知光譜(如水)確認基線正常，再相信數據
真實教訓：1mm 比色管卡匣如果用正常(normal)方向裝，卡匣底座會擋住較低處的光源，使基線升高、原本該有的特徵幾乎消失；反過來裝(inverted)才會量到正確的光譜。這正是為什麼QC 習慣一定要先量一次已知光譜(如水)確認基線正常，才敢相信接下來量到的數據。
重複性

重複掃描看什麼：SD 與 SNR

  • SD(標準差)——W01 ↗ 已經學過，描述同一樣品重複量測時，數值分散的程度
  • SNR(訊號雜訊比，signal-to-noise ratio) = 訊號大小 ÷ 雜訊的 SD；SNR 越大，代表訊號相對雜訊越乾淨
  • 光譜兩端通常光通量較低(光源/偵測器效率較差)→ 訊號較弱 → 通常會讓 SNR↓；但絕對 SD 是否也上升，要看雜訊來源與呈現的尺度，不能直接由「訊號較弱」推定——下一頁的重複掃描圖就會看到這個現象
  • 多次掃描平均可以降低雜訊：平均 n 次掃描，隨機雜訊大約降到原本的 1/√n；平均 5 次 → 雜訊降到原本的 1/√5 ≈ 1/2.2，等於雜訊改善約 2.2 倍
數據・重複性

重複掃描：5 次 → 平均光譜與 SD 光譜

示意數據/模擬光譜，x 軸為等間距的 Raman shift(cm⁻¹)。SD(以「平均±1SD」兩條線表示)在光譜兩端最大——光譜邊緣通常光通量較低、訊噪比較差，是重複性最不穩定的地方；中段訊號較強的區域反而較穩定。
安全守則

雷射防護 · 溶劑處理

🚫
Class 3B/4 雷射：絕不直視光束
依儀器規定使用護目鏡或機殼防護；雷射開啟時不要把眼睛湊近光路方向
💍
操作雷射時避免配戴反光飾品
戒指、手錶、金屬手鍊等反光物品可能造成意外反射，操作前先取下
🧴
乙醇／醋酸於通風處操作
避免直接吸入蒸氣或讓其接觸皮膚，比色管用畢加蓋、歸位
🧹
粉末／液體樣品外洩立即清理
依實驗室 SOP 處理外洩，避免交叉污染下一組的量測
小遊戲 ②儀器開機與校正流程排序— / 6
用 ▲▼ 把「開始一天量測前」的 6 個步驟排成正確順序。
小遊戲 ③這種樣品，容易產生螢光干擾嗎？0 / 6
把 6 種樣品分到「容易產生螢光干擾」或「不易產生螢光干擾」。
小遊戲 ④NIR / Raman 原理與校正 即時測驗0 / 5
實驗操作

純物質光譜量測 → 建立班級光譜庫

  • 粉末樣品(比色皿/粉末架)：蔗糖、阿斯巴甜(aspartame)、三氯蔗糖(sucralose)、赤藻糖醇(erythritol)、麥芽糊精(maltodextrin)
  • 液體樣品(比色管)：水、乙醇、醋酸
  • 每個樣品都要用本組固定的 NIR + 532nm 與 785nm 兩台 Raman(輪流)量測
  • 這些光譜會成為 W11 的班級光譜庫，也是 W15–16 甜味劑專題的參考光譜
532 vs 785 對照實驗：挑一個易螢光的樣品（如紅糖/黑糖，或未精製食用油），同時用 532nm 與 785nm 量測、疊圖比較螢光背景的差異——這就是把今天原理課教的「785nm 降低螢光」，在真實樣品上親手驗證一次。
小遊戲 ⑤決策挑戰：校正與 QC 判讀0 / 5
小遊戲 ⑥計算闖關：Raman shift → 絕對散射波長未作答
785 nm 雷射激發，矽晶圓 520.7 cm⁻¹峰。求散射光的絕對波長(nm)。公式：1/λ散射 = 1/λ雷射 − Δν̃（Δν̃ 換算成 cm⁻¹，波長換算成 cm 再取倒數）。
nm
4 小時課程時間表

原理＋安全 → 校正 → 量測 → 重複性 → 上傳

時間內容
0:00–0:50原理講解(波長/波數換算、NIR vs Raman、化學計量學路線圖)＋雷射與溶劑安全示範
0:50–1:30Raman 波數校正（矽晶圓、聚苯乙烯，532/785 各一次）與 NIR 暗電流／白參考／波長檢查
1:30–3:20純物質光譜量測：兩台 Raman 輪流量測全班，各組同時用自己固定的 NIR 量測
3:20–3:45挑一個樣品做 5 次重複掃描，繪製平均光譜與 SD 光譜
3:45–4:00檔案命名與上傳（命名規則：組別_儀器_樣品_重複.csv）
課後作業

檔案上傳與校正紀錄

📁
依命名規則上傳光譜
組別_儀器_樣品_重複.csv，把今天所有純物質光譜(含 5 次重複掃描)整理上傳
📝
一頁校正紀錄表
每台儀器各一頁：標準品、預期值、量測值、通過/不通過（Raman x軸、NIR 暗電流/白參考/波長）
🗂
檢查光譜庫完整性
確認每個樣品、每次重複都有上傳，這是 W11 建立班級光譜庫的基礎
🔬
為 W15–16 做準備
這些純物質光譜也是甜味劑專題的參考光譜，先把檔案整理好、標示清楚

今天上傳的光譜庫將在 W11 用 Colab NB09 ↗ 做前處理與相似度比對。

自我檢核

今天結束，你應該會…

點一下打勾——確認自己真的會了。

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