食品分析實驗 · W7
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食品分析實驗 · W7

糖:Brix 與酚硫酸法總醣

Sugar — Refractometry (Brix) and the Phenol–Sulfuric Acid Method
食品分析實驗 · 4 小時課程
折射計 Brix · 酚硫酸法總醣 · 標準曲線 QC · 乙級銅還原法(介紹)
Brix酚硫酸法 490nm標準曲線LOD/LOQ索摩基/Bertrand(乙級)
課前導覽影片(3 分鐘)

上課前先看:一束光與一滴酸的測糖之旅

內容:① 折射計 Brix(可溶性固形物 ≠ 純糖)→ ② 手持 NIR 糖度計(1050 nm 扣散射背景)→ ③ PLS 建模防資料洩漏 → ④ 酚硫酸法 490 nm 總醣 → ⑤ 標準品偏差與糖醇不顯色 → ⑥ 殘差圖、LOD/LOQ 與乙級索摩基滴定法。 在 YouTube 開啟 →

開始前,先看三支工廠影片
楓糖漿工廠說:40 加侖樹液 → 1 加侖糖漿?

楓糖漿產線(10:10–11:13,煮到比水沸點高約4°C↔66 °Brix) 柳橙汁產線 QC(06:56–07:57,折射計上線監控) 甜菜製糖產線(15:25–17:09,石灰精製)

影片裡的小提醒:甜菜製糖影片把石灰精製(liming)說成「提高濃度」, 但它真正做的是提高純度(purity)——先看影片,等一下上課我們會回來討論這個用詞差異。

今天的問題: 楓糖漿影片講的「40:1」聽起來像順口溜,用質量平衡驗算得出來嗎?(待會在「數據」段落回來解答)

互動實驗室

一束光與一滴酸的測糖之旅:預測 → 觀察 → 解釋

六幕:預測 → ① 折射計 Brix → ② 手持 NIR 扣背景 → ③ PLS 防資料洩漏 → ④ 酚硫酸法 490 nm → ⑤ 標準品偏差與糖醇 → ⑥ 殘差與乙級索摩基法。 另開實驗室 ↗

今天的學習目標

上完 W7,你應該會…

  • 操作折射計測 Brix,並知道 Brix 測的是「可溶性固形物」而不是「純糖」
  • 完成酚硫酸法(DuBois)總醣標準曲線,並算出未知樣品的總醣(g/100mL 葡萄糖當量)
  • 看懂為什麼標準品選葡萄糖 vs 果糖會造成系統性偏差(bias)
  • 區分還原糖 vs 非還原糖,理解糖醇為何在酚硫酸法中不顯色
  • 認識勞動部乙級(食品檢驗分析乙級技術士技能檢定)的索摩基法/Bertrand法(銅還原+滴定),並分辨它跟 Nielsen 教材「Somogyi–Nelson」比色法的不同
  • 遵守濃硫酸/酚的安全規範,完成 4 小時分工與數據 QC(標準曲線、殘差、LOD/LOQ)

理論複習:本課不重複 Brix、還原糖、總醣的完整定義與課本 vs 乙級方法比較——完整內容在 📖 完整原理 deck(Nielsen Ch19,含「課本 vs 乙級」比較)→。

原理 1

折射計 Brix:折射率 ↔ 可溶性固形物

光線經樣品折射後,肉眼從明暗交界線讀出刻度 入射光 採光蓋板 樣品薄層 臨界角光線 有光區 稜鏡(高折射率玻璃) 樣品折射率↑ → 臨界角↑ → 交界線移向暗區 目鏡視野(示意) 0510152025 暗區 亮區 刻度:°Brix(往暗區方向變大) 11.5 °Brix 明暗交界線=讀數 溫度靠 ATC 自動補償 酸、鹽等其他可溶物也會提高折射率 → 果汁 Brix ≈ 可溶性固形物,不等於「純糖」
定義:Brix 是以 20°C 下折射率對應「蔗糖 % (w/w)」所建立的刻度。果汁、糖漿裡除了糖,還有酸、鹽等其他可溶物也會提高折射率——所以樣品的 °Brix ≈ 可溶性固形物總量,不完全等於「純糖含量」,這也是待會要拿柳橙汁跟酚硫酸法總醣互相比較的原因。
溫度補償:現代手持/桌上型折射計多有 ATC(自動溫度補償),但仍建議在建議溫度範圍內操作。
延伸:非破壞 Brix

ATAGO PAL-HIKARi:不切開也能讀 Brix

果肉(糖、水) 果皮 紅外 LED 光源 偵測器 遮光隔板:擋住果皮表面 直接反射的光 光在果肉中散射,部分被糖與水吸收 interactance 量測示意:光源與偵測器並排貼在果皮上(示意圖)
  • 用紅外 LED 把光打進果實,偵測從果肉散射回來的光,不必切開、榨汁,樹上或採收後都能量
  • 儀器內建各水果專用的換算模型,所以依水果分型號(葡萄、草莓、蘋果、梨、芒果、洋香瓜、西瓜、玉米…超過 25 種),使用者不需自行校正
  • 讀數是模型推估的 Brix;這類儀器的模型一般以果汁的折射計 Brix 當參考值建立,所以準不準,仍要回到折射計驗證
  • 戶外陽光太強會干擾,螢幕顯示「nnn」提示要遮光後重測(外光干擾偵測)
原廠網頁沒有公開使用波長與準確度規格;但 ATAGO 的美國專利 US11099127 揭露了一種手持非破壞糖度計的設計,下一頁拆開來看(專利設計不等於一定是這台產品的規格)。ATAGO PAL-HIKARi 產品頁 ↗
延伸:拆開手持糖度計

ATAGO 專利 US11099127:光怎麼走

依專利 FIG. 17 簡化重繪(示意,非按比例) 果肉:光被吸收、散射 環形透鏡 環形透鏡 LED 沿圓周排列 6 種中心波長 導光 7 片帶通濾光片 感測器:各波長回返光強 Iₛ 深灰條=環形抵接部:貼住果皮、擋外光
  • 光路:LED 光經環形透鏡從外圈打進果肉,散射回來的光由中央導光件收集,再經濾光片到感測器——入射與收光分開,擋掉果皮表面的直接反射
  • 濾光片 875 nm 搭的是 880 nm LED;1050 與 1064 nm 兩片共用 1064 nm LED——LED 波長 ≠ 濾光片波長
專利沒有公開迴歸係數 b0–b8,也沒有準確度數字,所以不能用它重建或評價產品性能;這是「一種設計」,不等於 PAL-HIKARi 的實際規格。Google Patents 原文 ↗
  • 帶通濾光片:只讓一小段波長通過,感測器每次只量一個波長
延伸:拆開手持糖度計

從光強算出 Brix

濾光片中心 (nm)搭配的 LED 中心 (nm)用途
875880x1 = A875 − A1050
900900x2 = A900 − A1050
950950x3 = A950 − A1050
980980x4 = A980 − A1050
10201020x5 = A1020 − A1050
10501064共同參考
10641064x6 = A1064 − A1050
  • 吸光度 A=log₁₀(I₀/Iₛ):I₀ 打進去、Iₛ 收回來的光強
  • 都減 A1050:1050 nm 糖幾乎不吸收,當共同參考,扣掉果皮厚薄與散射造成的整體偏移
  • 多元迴歸 Ŷ=b0+b1x1+…:多個 x(波長差、兩個溫度)各乘係數相加;係數要用大量果實的折射計 Brix 建模(W13 的 PLS 是進階版)
小遊戲 ①計算闖關:光強 → 吸光度 → Brix(模擬數據)未作答
照專利的算法手算一次。875 nm:I₀ = 1000、Iₛ = 500;1050 nm:I₀ = 1000、Iₛ = 800(同一儀器單位 a.u.)。① A = log₁₀(I₀/Iₛ) 算 A875 與 A1050;② x1 = A875 − A1050;③ 代入教學假設式 Ŷ = 8 + 20·x1。求預測糖度 Ŷ。(此式只供練習運算,不是原廠係數,不能拿來算真的水果。)
°Brix
延伸:全光譜手持 NIR

Felix F-750:裡面是 Carl Zeiss MMS-1 光譜儀

  • 光譜儀:Zeiss MMS-1(VIS–NIR 加強版),310–1100 nm 連續光譜,256 像素矽光二極體陣列,約 3 nm 取樣、解析度約 10 nm
  • 為什麼穩:光柵、光纖入口與偵測器都固定在同一塊玻璃本體上,出廠就對準;熱漂移 < 0.01 nm/K,適合帶去果園
  • 量法:鎢絲燈寬頻光打在果皮上一圈環形區域,在果肉散射後由中央收光(interactance)——跟上一頁 ATAGO 專利是同一個概念
  • 預測:可溶性固形物(°Brix)、乾物質(DM)、果肉與果皮顏色、可滴定酸
  • 模型自己建:先量 10–200 顆訓練果+破壞性參考值(折射計 Brix、烘乾 DM),用原廠 Model Builder 以PLS(二次微分吸光度光譜)建模——就是 W10–W13 在做的事
  • 研究界常用:澳洲 CQU 的 Walsh 團隊 2000 年就用 MMS-1 建水果糖度模型;近年以 F-750 量芒果乾物質,RMSEP 約 0.8 %FW(Walsh 等,2024;這是乾物質,不是 °Brix)
  • 注意:F-751 系列(芒果、酪梨等專用機)改用 Hamamatsu 640–1050 nm 光譜儀、出廠內建模型,不是 MMS-1
原廠宣稱預測誤差 RMSEP 約 ±0.5 °Brix(RMSEP 是什麼見「看懂驗證指標」頁),這是自家數字;換品種、換產季都要重新驗證。本系的 Avantes 300–1100 nm 跟 MMS-1(310–1100 nm)幾乎同波段,可以拿自己的 PLS 結果來比。
Felix F-750 產品頁 ↗ Walsh 等 2024 ↗
近紅外 Brix 檢測

四種做法比一比:幾個波長 vs 整條光譜

做法量的是波長模型與校正主要誤差來源
折射計(本週操作)榨出果汁的折射率—(可見光)純水歸零、蔗糖檢查液溫度、果汁不均、取汁位置
ATAGO 手持(專利設計)果肉散射光,非破壞6 種 LED、7 個濾光片(875–1064 nm)多元線性迴歸+兩個溫度,原廠依水果建模品種、果皮厚度、溫度、量測位置、外光
Felix F-750(MMS-1)果肉散射光,非破壞310–1100 nm 連續光譜使用者自己用 PLS 建模同上,再加上模型的適用範圍
本課 NIR+PLS(W10–W13)果皮或果肉的反射光譜Avantes 300–1100、900–1650 nm;InnoSpectra NIR-S-G1 900–1700 nm自己用折射計 Brix 當參考值建 PLS同上,再加上探頭接觸與光纖位置

延伸名詞(倍頻/合頻、PLS、RMSECV)見 W10 原理 ↗ W13 品質指標 ↗

延伸活動

用本課的 NIR 儀器,自己驗證非破壞 Brix

課堂延伸活動:10 顆同種水果(如蘋果或柳橙),每顆在赤道位置標記 2 個點 → 兩台都量:Avantes 300–1100 nm(光纖反射探頭)與 InnoSpectra NIR-S-G1(900–1700 nm,貼在果皮上),每點各重複 3 次 → 全部 NIR 量完才切果,在同一點切取果肉、榨汁,用折射計測 Brix 當參考值 → 先看哪些波長和 Brix 相關,W13 再用這批資料建 PLS 模型、比較兩台儀器。一般而言短波近紅外穿進果肉較深,較長波長多只看到靠近果皮的部分,這正是兩台可以比較的地方。

下載:學生講義 PDF 實驗紀錄空白表 CSV
  • 怎麼判斷準不準:畫「折射計 Brix 對 NIR 預測值」散佈圖,加上 y = x 線;算 Bias(偏差)、MAE(平均絕對誤差)、RMSEP(預測均方根誤差)——下一頁用白話解釋
  • 60 筆 ≠ 60 顆:10 顆 × 2 個點 × 3 次重複是 60 筆讀值,但獨立樣品只有 10 顆;重複只反映重複性
  • 別讓資料洩漏:同一顆果的所有讀值要一起放進訓練組或測試組,隨機拆開會讓 RMSEP 看起來太好
  • 練習:用 8 顆模擬果實的測試集算 Bias、MAE、RMSEP(測試集 CSV);七通道光強換算可對照 光強模擬 CSV。兩份都是教學模擬數據,不是專利實測或儀器性能
看懂驗證指標

Bias、MAE、RMSEP:預測差多少

縮寫中文公式白話
Bias偏差Σ(ŷ − y) / n平均起來偏高還是偏低(正=高估);正負會互相抵銷,所以 Bias ≈ 0 不代表準
MAE平均絕對誤差
Mean Absolute Error
Σ|ŷ − y| / n不管正負,平均每顆差幾 °Brix;最直觀
RMSEP預測均方根誤差
Root Mean Square Error of Prediction
√[ Σ(ŷ − y)² / n ]先平方再平均再開根號,大誤差會被放大;單位也是 °Brix,論文與原廠最常報這個

y=折射計參考值,ŷ=NIR 預測值,n=獨立果實數。同一個公式,用訓練組算叫 RMSEC、交叉驗證算叫 RMSECV、用沒參與建模的測試組算才叫 RMSEP。其他縮寫:NIR=近紅外光,PLS=偏最小平方迴歸,DM=乾物質。

3 顆果的小算例(示意數據):參考 10.0/12.0/14.0,預測 10.5/11.5/14.6 °Brix → 誤差 e = ŷ − y = +0.5/-0.5/+0.6
Bias = +0.20 MAE = 0.53 RMSEP = 0.54 °Brix
Bias 只有 +0.20,是因為 +0.5 和 −0.5 抵銷了;每顆其實都差半度左右,要看 MAE、RMSEP 才知道。
想多學一點:化學計量學課程
原理 2

酚硫酸法 (DuBois, 1956):總醣比色定量

  • 濃硫酸使醣類水解+脫水,生成呋喃醛衍生物(furfural derivatives)
  • 此衍生物與酚縮合,產生穩定的橙黃色產物,於 490 nm 比色
  • 可測總醣(總碳水化合物),包含蔗糖與寡糖(不像銅還原法只測還原糖);注意這不是營養標示的「糖」,標示的糖只算游離單醣與雙醣
  • 糖醇不反應(sorbitol、erythritol 等)——待會 g3 遊戲會驗證
  • 不同糖(如果糖 vs 葡萄糖)的莫耳顯色率不同,換標準品會有系統性偏差
  • 顯色非嚴格化學計量,因此一定要有自己的標準曲線
  • 濃硫酸要一次快速加到液面:瞬間放熱使脫水反應快速均勻;沿壁慢加易分層、顯色不一致
酚硫酸法(DuBois)操作流程 ① 取 2 mL 樣品/標準液 置於試管 ② 加 1 mL 5% 酚液 混合 ③ 快速加 5 mL 濃硫酸 直接加到液面上(抽風櫃) ④ 靜置 10 分鐘 後混合均勻 ⑤ 25–30°C 水浴 10–20 分鐘顯色 ⑥ 490 nm 讀吸光值 橙黃色,比對標準曲線 ⚠ 濃硫酸放熱劇烈+酚具毒性 全程在抽風櫃、戴面罩與耐酸手套操作
比色定量

從顏色到濃度:標準曲線

統計 Ch04 標準曲線 ↗ 📖 完整原理 deck(UV-Vis 比色)→

還原糖 vs 非還原糖

看異頭碳有沒有空出來

乙級 vs 課本

乙級介紹:銅還原法怎麼定量還原糖(本堂課不操作)

方法 ⇅定量方式 ⇅顯色/滴定劑 ⇅終點/波長 ⇅適用糖類 ⇅屬性 ⇅
四種方法都是先讓還原糖把 Cu²⁺ 還原成 Cu₂O,差別在「怎麼把 Cu₂O 的量讀出來」;點欄位標題可排序比較。蔗糖必須先用酸或轉化酶轉化(invert)成還原糖,才能被前三法測到。
小遊戲 ②還原糖 vs 非還原糖:這 8 種糖分到哪一邊?0 / 8
把 8 種糖分到「還原糖」或「非還原糖」。
校正

開始操作前,先校正三樣東西

💧
折射計歸零
以蒸餾水在 20°C 歸零;再用10.0% (w/w) 蔗糖標準液檢查,應讀出 10.0 °Brix
⬛
分光光度計歸零
以試劑空白(不含糖,僅酚+濃硫酸)歸零,扣除試劑本身的吸光背景
📈
每次操作都做標準曲線
葡萄糖標準液 0、20、40、60、80、100 µg/mL,每批次重新做一條曲線,不沿用舊曲線
4 小時課程時間表

分工與抽風櫃輪站

時間內容
0:00–0:30講解+安全示範:濃硫酸/酚操作規範,抽風櫃使用
0:30–1:15折射計校正(蒸餾水歸零+蔗糖標準液查核)與各樣品 Brix 測定
1:15–1:45配製葡萄糖標準液、稀釋樣品(楓糖漿/柳橙汁/運動飲料/冬瓜茶)
1:45–3:00酚硫酸顯色反應與 490 nm 讀值(全程在抽風櫃內操作)
3:00–3:40乙級方法介紹+計算練習(索摩基/Bertrand,不動手操作)
3:40–4:00標準曲線繪製、數據輸入彙整表
安全守則

濃硫酸 · 酚 · 抽風櫃

🥽
濃硫酸加水劇烈放熱
全程面罩+耐酸手套;務必在抽風櫃內把酸快速加到液面,勿反向加水入酸
☠️
酚具毒性,會經皮膚吸收
戴手套操作,避免接觸皮膚;酚廢液不可與一般廢液混合,需獨立收集
🌡️
熱試管勿直接手持
水浴後的試管很燙,用試管夾取放,冷卻後再操作分光光度計
🧴
濃硫酸/酚廢液分開收集
依實驗室 SOP 分類收集,不可直接倒入水槽
小遊戲 ③酚硫酸法操作步驟排序— / 6
用 ▲▼ 把酚硫酸法(DuBois)顯色反應的 6 個步驟排成正確順序。
數據・標準曲線

酚硫酸法標準曲線:葡萄糖 0–100 µg/mL

示意數據(非本班實測)。迴歸:A = 0.0101×C + 0.0308,R² = 0.9994。
QC

R² 迷思:高 R² 不代表迴歸品質好

殘差圖(示意數據)
  • 本組標準曲線 R² = 0.9994(看起來很漂亮),但殘差在兩端偏負、中間偏正,呈弧形——這就是該檢查而非只看 R²的訊號
  • LOD = 3.3σ/斜率 ≈ 3.50 µg/mL;LOQ = 10σ/斜率 ≈ 10.62 µg/mL(σ 這裡取迴歸殘差標準差,實務上也常直接用多次空白讀值的 SD,原理相同)
  • 低於 LOQ 的樣品讀值只能定性、不宜報定量結果
樣品與數據

四個樣品,一個對照組討論

  • 楓糖漿:需先大量稀釋才落在標準曲線範圍內
  • 柳橙汁:同時做 Brix 與酚硫酸總醣,互相比較
  • 運動飲料:常見高果糖糖漿(HFCS),注意標準品選擇的偏差
  • 冬瓜茶:深色樣品,注意稀釋後顏色是否仍會干擾比色,並以不加酚的樣品空白扣除背景色
柳橙汁對照(示意數據):Brix ≈ 11.5 °Brix vs 酚硫酸總醣 ≈ 9.5 g/100mL(葡萄糖當量),差 ≈ 2.0。差距主要來自 Brix 把酸與其他可溶性固形物也算進去,而酚硫酸法只對醣類顯色,加上果糖/葡萄糖等不同糖的顯色率差異也會造成小幅落差。
質量守恆(示意計算,回應開場的 40:1):

樹液 2%、糖漿 66% → 質量比 = 66/2 = 33 : 1

體積比需乘密度校正:
33 × (糖漿密度1.33 / 樹液密度1.008) ≈ 43.5 : 1

Rule of 86:86/2% ≈ 43 : 1,跟上面算出的體積比一致;影片說的「40:1」只要樹液糖度略高一點(約 2.18%)就能剛好對上——量級吻合,這個說法禁得起質量平衡的驗算。

小遊戲 ④計算闖關:運動飲料總醣 (g/100mL)未作答
運動飲料稀釋 1000 倍後,取 2 mL 依酚硫酸法顯色,490 nm 讀得 A = 0.637。已知標準曲線 A = 0.0101×C + 0.0308(C 單位 µg/mL)。求原樣品的總醣(g/100mL,葡萄糖當量)。公式:C=(A−b)/斜率;總醣 = C×稀釋倍數×10⁻⁴。
g/100mL
小遊戲 ⑤Brix 與酚硫酸法 即時測驗0 / 5
小遊戲 ⑥酚硫酸法:測得到 vs 測不到0 / 6
把 6 種物質分到「酚硫酸法測得到」或「酚硫酸法測不到」。
小遊戲 ⑦決策挑戰:方法判斷(含乙級題型)0 / 5
課後作業

Colab NB07

📥
整理標準曲線數據
本組葡萄糖標準液的吸光值,計算迴歸方程式與 R²
📊
算 LOD / LOQ
用殘差 SD(或空白 SD)算 3.3σ/斜率 與 10σ/斜率
🆚
柳橙汁 Brix vs 總醣
討論兩者為什麼不同,把「酸也算進 Brix」講清楚
🧮
一題乙級計算
從 Bertrand 或索摩基法的滴定量換算還原糖含量

Colab NB07:在 Colab 開啟 NB07 ↗ ・入門(不用寫程式):Excel 練習檔 EX07 ⬇。報告需附:各樣品 Brix 與總醣結果、標準曲線與殘差、LOD/LOQ、柳橙汁 Brix vs 總醣討論、一題乙級計算。

自我檢核

今天結束,你應該會…

點一下打勾——確認自己真的會了。

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